人脂肪來源干細胞與聚己內酯/殼聚糖支架的生物相容性研究

周 哲 吳稼晟 張 明 趙 陽 周 娟 李 偉 王 忠 孫 康 盧慕峻

人脂肪來源干細胞與聚己內酯/殼聚糖支架的生物相容性研究

周 哲 吳稼晟 張 明 趙 陽 周 娟 李 偉 王 忠 孫 康 盧慕峻

目的觀察人脂肪來源干細胞（Human adipose derived stem cells，hADSCs）在聚己內酯/殼聚糖[Poly(ε-caprolactone)/chitosan，PCL/CS]支架中的生長情況。方法取PCL/CS浸提液培養hADSCs，CCK-8法檢測細胞活力，評價支架細胞毒性。hADSCs傳代擴增后，接種到PCL/CS支架上，體外培養1周、2周，裸鼠體內培養2周，HE染色觀察細胞在支架上的生長情況，免疫組化HLA-Ⅰ監測經裸鼠體內培養后復合支架上細胞的種屬來源。結果hADSCs在PCL/CS浸提液中可保持較高的增殖率，PCL/CS浸提液無細胞毒性。hADSCs終止于PCL/CS支架后，經過體外、內培養，hADSCs均能長入支架的空隙內，且體內培養比體外培養有更多的細胞長入支架。體外培養1周，已有細胞黏附生長在PCL/CS支架的邊緣，體外培養2周后，部分細胞滲透到材料內部。體內培養2周后，大量細胞能滲透到材料內部，同時HLA-Ⅰ抗體檢測發現，支架材料內部分細胞HLA-Ⅰ陽性表達，說明PCL/CS支架內該部分的細胞來源于hADSCs。結論PCL/CS支架安全無毒，hADSCs能在PCL/CS支架上較好生長，該支架可用于組織工程膀胱的研究。

人脂肪來源干細胞聚己內酯殼聚糖支架組織工程

大面積膀胱缺損的修復一直是臨床面臨的難題，組織工程技術修復大面積膀胱缺損已成為目前的研究熱點。脂肪來源干細胞（Human adipose derived stem cells，hADSCs）具有自我更新及多向分化潛能，較易獲得，適合作為組織工程膀胱修復的種子細胞。聚己內酯[Poly(ε-caprolactone)，PCL]是由ε-己內酯開環聚合所得到的線性脂肪族聚酯，具有良好的生物降解性和生物相容性，具備一定的力學強度和藥物通過性[1]。殼聚糖（Chitosan，CS）結構與細胞外基質中的主要成分糖胺聚糖十分類似，也是現今所發現的惟一具有明顯堿性、帶有正電荷的天然多糖[2]。研究表明，聯合CS的生物活性及PCL的機械性能制造出的復合支架，比單一成分支架具有更好的親水性、生物活性和機械強度[3-5]。

本實驗將hADSCs置于PCL/CS浸提液中培養，檢測PCL/CS的細胞毒性，并將hADSCs種植于PCL/CS支架上，進行體外、體內培養，觀察細胞生長情況，探討PCL/CS作為hADSCs的支架材料用于組織工程膀胱缺損的修復的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

hADSCs取自人抽脂術后廢棄的脂肪組織。PCL（SOLVAY公司），CS（國藥集團化學試劑有限公司），PCL/CS復合支架由上海交通大學材料科學與工程學院制作。兔抗人HLA-Ⅰ抗體（Epitomics公司）。

1.2 方法

1.2.1 hADSCs的分離培養

將抽脂術后廢棄的人脂肪組織，洗去血細胞和麻醉液。加入等體積的0.1%的膠原酶Ⅳ，37℃恒溫振蕩消化1 h；離心去除懸浮的脂肪和上清液，含10%胎牛血清的低糖DMEM培養基重懸細胞，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養箱中進行單層細胞培養。48 h后更換培養液1次，以后每3天換液1次。6～8 d細胞生長融合達80%～90%后，0.5%胰酶-EDTA消化，按1:3進行傳代培養。

1.2.2 PCL/CS支架的制備及掃描電鏡觀察

將CS與PCL按照質量以2:8混合后，與過篩后的氯化鈉（粒徑約為50～120 μm）按照體積百分比1:9混合，在轉矩流變儀中共混，共混溫度為140℃。共混物在平板硫化機上壓模成型,放入去離子水浸泡，真空冷凍干燥后，得到PCL/CS多孔支架。

將上述方法制備得到的PCL/CS支架噴金鍍膜，在液氮中脆斷，噴金處理，掃描電鏡觀察。

1.2.3 支架材料孔隙率測量

將制備的PCL/CS烘干，分析天平精確稱重后，計算PCL/CS孔隙率。

1.2.4 hADSCs在PCL/CS浸提液中增殖率的測定

PCL/CS支架以75%乙醇浸泡消毒過夜；洗去殘留乙醇，加入DMEM培養基，置37℃、5%CO2的飽和濕度培養箱中24 h，收集浸提液。取增殖能力較強的第3代hADSCs，接種于96孔板中培養。24 h后吸出培養基，分別添加100 μL DMEM培養基（對照組）和PCL/CS浸提液（實驗組），繼續培養。于第1、3、7天，每組各取5個孔，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續培養1 h后，酶標儀測定450 nm波長時的A值，計算相對增殖率，進行毒性分級。

1.2.5 hADSCs種植于PCL/CS支架

將消毒后的PCL/CS支架裁成10 mm×10 mm大小，PBS沖洗，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養基預培養過夜。吸棄上清及材料表面的培養基，選取生長良好的第3代hADSCs，制成密度為2×106cells/mL的細胞懸液，每個材料表面均勻滴加1 mL細胞懸液，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養基，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養箱中。用于體內試驗的細胞材料復合物，在體外培養3 h后，植入裸鼠皮下。用于體外實驗的支架，繼續在培養箱中培養，3 d換液一次。

1.2.6 組織學觀察

體外培養的細胞－支架復合物于培養后1周、2周取材，體內培養的于培養后2周取材，4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片（6 μm厚），HE染色，光鏡下觀察細胞在支架內的生長情況。

1.2.7 體內培養的細胞－支架復合物免疫組化檢測

體內培養的細胞－支架復合物于2周后取材，石蠟切片，3%過氧化氫溶液去除內源性過氧化物酶，0.1%胰酶修復抗原，滴加羊血清封閉非特異性抗原。一抗為兔抗人HLA-Ⅰ抗體，4℃過夜。二抗為偶聯過氧化物酶的羊抗兔單克隆抗體，DAB顯色。蘇木素襯染細胞核，1%鹽酸乙醇分化，95%～100%乙醇脫水，二甲苯透明處理，中性樹膠封片。

1.2.8 統計學分析

SPSS17.0軟件進行統計學分析，數據以均數±標準差表示。實驗組與對照組各時間點A值的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hADSCs的形態和生長特性

原代細胞培養6 h后，已有部分成纖維細胞樣細胞貼壁。貼壁細胞呈梭形，其間也可見少量三角形、多邊形細胞（圖1A）。隨著培養時間的延長，貼壁細胞呈集落狀生長，集落大小不一，含數個至數百個細胞不等，集落中細胞形態為典型的梭形細胞。培養6～8 d細胞可達80%～90%融合，9～10 d可形成100%融合的致密單層。傳代后的細胞形態主要為梭形，少數為三角形或多邊形（圖1B）。流式細胞鑒定示，CD29表達為99.77%，CD44表達為97.1%，CD73表達為96.54%，CD105表達為93.06%，CD45表達為0.37%，CD34表達為1.38%[6]。上述結果表明，我們分離得到的細胞是hADSCs。

圖1 hADSCs形態學觀察（40×）Fig.1Histological observation of hADSCs(40×)

2.2 支架材料的制備

制備的PCL/CS多孔支架外觀呈白色（圖2A），掃描電鏡觀察孔徑為100 μm左右（圖2B），孔隙率為88.76%，與理論值（約90%）相似。

圖2 PCL/CS支架材料大體觀及掃描電鏡觀察Fig.2Gross observation and SEM observation of PCL/CS

2.3 hADSCs在PCL/CS浸提液中增殖率的測定

第1、3、7天實驗組細胞的相對增殖率分別為98.6%、101.6%和110.3%，平均相對增殖率為103.5%，和對照組無顯著差異（P＞0.05），說明浸提液對細胞增殖無明顯影響，浸提液在第1、3、7天的細胞毒性分別為Ⅰ級、0級和0級，說明細胞在浸提液中可保持良好的增殖，PCL/CS浸提液無細胞毒性。

2.4 細胞在支架上的生長情況

接種hADSCs于體外、體內培養后，支架無明顯收縮。組織學檢測結果顯示，體外、體內培養的細胞－支架復合物中，hADSCs均能長入支架孔隙內，且體內培養比體外培養有更多的細胞長入。體外培養1周，已有細胞黏附生長在PCL/CS支架的邊緣；體外培養2周后，部分細胞滲透到支架內部；體內培養2周后，大量細胞能滲透到支架內部。同時HLA-Ⅰ抗體檢測發現，支架內細胞陽性表達（圖3）。

圖4 hADSCs復合PCL/CS支架組織學檢測及免疫組化檢測（200×）Fig.4Morphological observation and immunohistochemical observation of PCL/CS scaffold compound with hADSCs(200×)

3 討論

組織工程膀胱缺損的修復主要涉及平滑肌細胞（Smooth muscle cell，SMC）和尿路上皮細胞（Urothelial cell，UC）。研究表明，ADSCs通過體內外誘導能夠向SMC分化，表達平滑肌特異性的標志物并具備收縮和舒張的功能，可用于修復膀胱肌層缺損[7-11]；ADSCs還能向UC表型分化[6，12-13]。ADSCs具有來源豐富、取材方便及對患者損傷小等優勢，已成為組織工程膀胱修復的理想種子細胞。

組織工程支架材料應具有良好的組織相容性、機械和物理性能，并可按預期設計的時間降解和吸收，降解產物無毒性[14]。我們前期分別用脫細胞基質（BAMG）和人工合成材料（PGA）作為支架材料，進行膀胱壁復層結構的體外構建[15-16]。發現BAMG支架材料機械強度較好，但支架內部細胞滲透性較差。單純PGA材料雖然具有良好的生物相容性、可降解性和可塑性等優點，但降解時間較短，機械強度較差，其酸性降解產物可影響種子細胞的活力。單純來源支架材料的缺陷促使近年來復合支架材料的研究成為趨勢[17-20]。PCL具有良好的生物降解性、力學性能、藥物通過性和生物相容性，降解產物對人體無毒。但PCL具有高度疏水性，缺乏生物活性。CS作為一種天然細胞外基質，具有良好的生物相容性和促進體內細胞黏附和增殖的優點，能夠有效彌補單純PCL支架材料的缺陷。研究表明，聯合殼聚糖的生物活性及PCL的機械性能制備的復合支架，比單一成分支架具有更好的生物學和機械性能。PCL/CS與多種細胞都具有良好的生物相容性，是較為理想的支架材料[5，21-22]。

本實驗將hADSCs在PCL/CS浸提液中培養1、3、7 d，結果顯示各時間點實驗組和對照組A值無顯著性差異（P＞0.05）。說明PCL/CS浸提液不存在明顯的細胞毒性。hADSCs種植于PCL/CS支架后，經體外、體內培養，細胞均能長入PCL/CS支架的孔隙內，說明PCL/CS支架具有良好的細胞親和性，進一步說明了PCL用CS修飾后，其疏水性能得到較大改善，有利于細胞的黏附生長。體內培養比體外培養有更多的細胞長入支架，可能是由于體內環境為細胞生長提供了豐富的血供和營養。體外培養1周時，已有細胞黏附生長在PCL/CS支架的邊緣；2周后，部分細胞滲透到材料內部，細胞數量明顯增多，這可能是細胞在材料內部擴增的結果，hADSC體外傳代擴增時間為5 d左右，1周后細胞在支架上可以實現倍增。體內培養2周后，大量細胞能滲透到材料內部，同時細胞周圍可見大量細胞外基質；HLA-Ⅰ抗體檢測發現，支架材料內部分細胞陽性表達，說明PCL/CS支架內的細胞來源于人，即hADSCs。體內外構建結果表明，PCL/CS復合材料適合ADSCs的黏附、生長和增殖。

本實驗結果表明，PCL/CS復合支架材料安全、無毒，ADSCs能在PCL/CS支架上較好地黏附和增殖，有望進一步用于體內組織工程膀胱修復的研究。

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Experimental Study on Human Adipose-Derived Stem Cells Co-cultured with Poly(ε-Caprolactone)/Chitosan Scaffold

ZHOU Zhe1,WU Jiasheng2,ZHANG Ming1,ZHAO Yang1,ZHOU Juan1,LI Wei2,WANG Zhong1,SUN Kang2,LU

Mujun1.1 Department of Urology,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011,China;2 State Key Lab of Metal Matrix Composites,Shanghai Jiaotong University School of Materials Science and Engineering,Shanghai 200240,China.Corresponding author:LU Mujun(E-mail:lumujun@163.com).

ObjectiveTo observe the growth of human adipose derived stem cells(hADSCs)cultured with Poly(εcaprolactone)/chitosan biomaterials in vitro and in vivo.MethodshADSCs were isolated from human subcutaneous adipose tissue after collagenase digesting,filtrating and centrifuging.The scaffold was prepared by freeze-drying technique and the method of vacuum thermal cross-linking and it's cytotoxicity was evaluated by CCK-8 reagent tests.Then the hADSCs of passage 3 were seeded onto the PCL/CS scaffolds and the growth of hADSCs cultured in PCL/CS biomaterials was observed by HE staining.The cells in the scaffolds cultured in vivo were detected by immunohistochemistry.ResultshADSCs could maintain high increment rate in the leaching solution of the PCL/CS and the PCL/CS scaffolds were non-toxic.The histological study found that hADSCs could grow into the space of the PCL/CS scaffolds after cultured in vitro and in vivo, and there were more cells in the scaffolds cultured in vivo than in vitro.When cultured in vitro,some cells adhered at the edge of the PCL/CS 1 week later and more cells grew into the inside of the scaffolds after 2 weeks.When cultured in vivo,a great deal of cells grew into the scaffolds,and immunohistochemistry results suggested that the cells inside the scaffolds were hADSCs.ConclusionPCL/CS scaffolds are non-toxic and have a good biocompatibility with hADSCs,which can be used as a vehicle for hADSCs in bladder defect reconstruction.

Human adipose derived stem cells;Poly(ε-caprolactone);Chitosan;Scaffold;Tissue engineering

Q813.1+2

A

1673－0364（2013）03－0133－04

2013年4月6日；

2013年4月28日）

國家自然科學基金項目（81070605）；上海交通大學“醫工（理）交叉研究基金”（YG2011MS14）；上海市教委科研創新項目（09YZ76）。

200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院泌尿外科（周哲，張明，趙陽，周娟，王忠，盧慕峻）；200240上海市上海交通大學材料科學與工程學院金屬基復合材料國家重點實驗室（吳稼晟，李偉，孫康）。

盧慕峻（E-mail：lumujun@163.com）。

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.03.004