葉黃素對(duì)體外培養(yǎng)的人食管癌Ec-9706細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2013-03-03 04:46:42任廣偉高福祿

河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 2013年3期

李莉，任廣偉，趙昱，龔淼，孟麗，高福祿

（1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河北石家莊050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院腎內(nèi)科，河北石家莊050031；3.河北師范大學(xué)生命科學(xué)院，河北石家莊050024）

·論著·

葉黃素對(duì)體外培養(yǎng)的人食管癌Ec-9706細(xì)胞增殖和凋亡的影響

李莉1，任廣偉2，趙昱1，龔淼1，孟麗1，高福祿3*

目的探討葉黃素對(duì)體外培養(yǎng)的人食管癌9706細(xì)胞（esophageal carcinoma 9706，Ec-9706）增殖和細(xì)胞凋亡的影響。方法將Ec-9706細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMIl640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2/95%空氣飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其隨機(jī)分為4組：對(duì)照組（C組）和不同濃度葉黃素組（L1～3組）。L1～3組分別加入40、80和160μmol/L葉黃素；C組加入等體積RPMI1640培養(yǎng)液。采用噻唑蘭法檢測不同濃度葉黃素對(duì)人食管癌Ec-9706細(xì)胞增殖的影響；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測Ec-9706細(xì)胞凋亡情況；采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測Fas、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、cyclin D1和Caspase-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果葉黃素可抑制Ec-9706細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)Ec-9706細(xì)胞的凋亡，且呈劑量依賴性。葉黃素可下調(diào)Ec-9706細(xì)胞PCNA和cyclin D1蛋白表達(dá)，上調(diào)Fas和Caspase-3蛋白表達(dá)，且呈劑量依賴性。結(jié)論葉黃素可抑制體外培養(yǎng)的人食管癌Ec-9706細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，且呈濃度依賴性，其機(jī)制與下調(diào)PCNA和cyclin D1蛋白表達(dá)，上調(diào)Fas和Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。

食管腫瘤；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；葉黃素

葉黃素是廣泛存在于自然界植物中的一種含氧類胡蘿卜素。流行病學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，葉黃素在視覺保護(hù)、增強(qiáng)免疫功能、預(yù)防慢性病和降低癌癥發(fā)生等方面有廣泛的生物學(xué)活性［1］。有研究［2］表明，葉黃素在抗消化道腫瘤方面有顯著作用，尤其是食管癌。但其機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究擬探討葉黃素對(duì)體外培養(yǎng)的人食管癌9706細(xì)胞（esophageal carcinoma 9706，Ec-9706）增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器：RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），胎牛血清（杭州四季青生物制品公司），噻唑蘭和碘化丙啶熒光染料（Sigma公司，美國），兔抗人 Fas抗體、兔抗人增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體、兔抗人cyclin D1抗體和兔抗人Caspase-3抗體、SP試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），葉黃素（Sigma公司，美國），胰蛋白酶（Sigma公司，美國）；HF-212UV CO2恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司），Motic AE31倒置顯微鏡（Motic公司，德國），DG5031型酶聯(lián)免疫檢測儀（上海華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備公司），Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter公司，美國）。

1.1.2 細(xì)胞株：Ec-9706細(xì)胞株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所建系，本實(shí)驗(yàn)室凍存。將Ec-9706細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2/95%空氣飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天用0.25%胰酶消化，以1∶2傳代1次。

1.2 方法

1.2.1 葉黃素溶液的配制：實(shí)驗(yàn)前將葉黃素用1mL二甲基亞砜充分溶解，用 RPMI1640培養(yǎng)液配成終濃度為320μmol/L的母液，4℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組：采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組（C組）和不同濃度葉黃素組（L1～3組）。L1～3組分別加入40、80和160μmol/L葉黃素；C組加入等體積RPMI1640培養(yǎng)液。

1.2.3 葉黃素對(duì)Ec-9706細(xì)胞增殖影響的測定：取對(duì)數(shù)生長期的Ec-9706細(xì)胞和正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔滴加200μL單細(xì)胞懸液，使每孔含1.7×103個(gè)細(xì)胞，設(shè)8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)接種6個(gè)96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h。分別在孵育24、48和72h，取出2塊培養(yǎng)板，每孔滴加噻唑蘭溶液（5g/L）20μL，37℃培養(yǎng)箱孵育4 h后終止培養(yǎng)。棄上清，每孔滴加二甲基亞砜200μL，振蕩15 min。酶標(biāo)儀在570 nm處測定各孔吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率 =（1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值）×100%。

1.2.4 葉黃素對(duì)Ec-9706細(xì)胞凋亡影響的測定：取12瓶對(duì)數(shù)生長期 Ec-9706細(xì)胞，分別于24、48和72h取出不同藥物濃度細(xì)胞4瓶，收集細(xì)胞分別放入4個(gè)15mL離心管內(nèi)標(biāo)記后進(jìn)行離心，制成濃度為7×108個(gè)/L的單細(xì)胞懸液離心后棄上清液緩慢加入預(yù)冷70%無水乙醇7mL，4℃過夜。采用碘化丙啶單染法，每份樣品中加入雞紅細(xì)胞作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，與樣品同步染色，每份樣品中加入1mL碘化丙啶染液，在4℃避光孵育30min。用488nm氬離子激光器激發(fā)由630nm帶通濾光片接收，通過散點(diǎn)圖收集10 000個(gè)細(xì)胞，分析碘化丙啶熒光直方圖上凋亡細(xì)胞百分率。

1.2.5 Fas、PCNA、cyclin D1和Caspase-3蛋白表達(dá)的測定：取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞制成濃度為1×107個(gè)/L的單細(xì)胞懸液，接種到放有蓋玻片的6孔板，培養(yǎng)箱孵育24h，使細(xì)胞貼壁于蓋玻片上。分別于孵育24、48和72h后取出蓋玻片，SP法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，3%甲醇-H2O2室溫處理10min，微波抗原修復(fù)（9℃）15min。免疫細(xì)胞化學(xué)染色。用已知陽性切片作為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。采用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，每張玻片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，測定特異性著色的積分光密度值，反映目的蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，分別采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 葉黃素對(duì)Ec-9706細(xì)胞增殖的影響：與C組比較，L1～3組細(xì)胞增殖抑制率升高，且呈濃度依賴性，見表1。

表1 4組Ec-9706細(xì)胞增殖抑制率比較Table 1 Comparison of inhibitory rate of Ec-9706 cells proliferation in 4 groups（n=7，±s，%）