HPLC法測定硝克柳胺的含量及有關物質

王 樂，王婭莉，趙 玉，牛長群，郭 麗

（1.河北化工醫藥職業技術學院制藥工程系藥物制劑教研室，河北石家莊050026；2.華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司儀器分析研究室，河北石家莊050015；3.河北醫科大學第四醫院藥品科，河北石家莊050011）

·論 著·

HPLC法測定硝克柳胺的含量及有關物質

王 樂1，王婭莉2，趙 玉2，牛長群2，郭 麗3*

（1.河北化工醫藥職業技術學院制藥工程系藥物制劑教研室，河北石家莊050026；2.華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司儀器分析研究室，河北石家莊050015；3.河北醫科大學第四醫院藥品科，河北石家莊050011）

目的建立硝克柳胺含量和有關物質的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定方法。方法采用Inertsil C8柱（250mm×4.6mm，5μm，GL Sciences Inc.）；流動相為水-乙腈-四氫呋喃（50∶50∶1）（內含0.1%磷酸）；流速為1.0mL/min；檢測波長為330nm；柱溫為30℃。結果在選定色譜條件下，主峰與有關物質峰分離度良好，硝克柳胺在0.02～1.0g/L濃度范圍內線性關系良好（r=0.999 6）；平均回收率為100.1%（n=9）；檢測限為0.1ng。結論該方法專屬性強、靈敏度高、操作簡便，可用于測定硝克柳胺的含量及有關物質。

硝克柳胺；色譜法，高壓液相；研究設計

慢性腎臟疾病是我國最為常見的慢性難治性疾病之一。目前國外已開發出血管緊張素轉化酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）［1-4］和血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑（angiotensin Ⅱ type 1 receptor antagonist，AT1RA）［5-10］兩類治療藥物，至今國內尚未成功開發出通過其他途徑干預轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）的治療藥物。硝克柳胺（nicousamide）是我國自主研發的治療腎功能不全的小分子全新化合物［11］，具有毒性低、活性較高、作用機制新等特點［12］。由于硝克柳胺為首創藥物，尚無合理、有效的質量控制標準，本文根據其合成工藝路線及化學結構特征，建立了高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定硝克柳胺的含量及有關物質的方法，旨在為該藥物的質量控制提供必要的檢測手段。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：Wates公司Alliance 2010型高效液相色譜儀，515泵、717自動進樣器，2487檢測器，Empower化學工作站。

1.2 試藥：硝克柳胺樣品（批號050401、050402、050403）、硝克柳胺對照品（純度 ＞99.0%，批號040801），均由中國醫學科學院藥物研究所合成室提供；色譜乙腈（邯鄲林峰）；四氫呋喃、磷酸、N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethyl formamide，DMF）均為分析純，華北制藥純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件：色譜柱 Inertsil C8柱，250mm× 4.6mm，5μm，（GL Sciences Inc.）；流動相水 -乙腈-四氫呋喃（50∶50∶1）（內含0.1%磷酸）；流速1.0mL/min；檢測波長330nm；柱溫30℃；進樣量10μL。

在上述條件下，硝克柳胺與相鄰雜質峰完全分離（圖1），理論板數按硝克柳胺峰計為4 489，拖尾因子為0.977 2。

圖1 硝克柳胺有關物質檢查系統適應性HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatogram of system suitability of nicousamide's related substance

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液：精密稱取硝克柳胺對照品20mg，置100mL量瓶中，用DMF溶解并定容，搖勻，即得0.2g/L對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液：同上法，制得0.2g/L的供試品溶液。

2.2.3 自身對照溶液：精密量取供試品溶液1mL，置100mL量瓶中，用DMF定容，搖勻，得2mg/L的自身對照溶液。

2.3 專屬性試驗：對硝克柳胺樣品分別進行加熱、強酸、強堿、氧化、光照、高濕破壞處理后進行測定。結果表明，硝克柳胺與破壞后產生的降解產物均能完全分離（圖2）。

圖2 硝克柳胺有關物質檢查專屬性試驗HPLC色譜圖A.熱破壞；B.酸破壞；C.堿破壞；D.氧化破壞；E.光照破壞；F.高濕破壞Figure 2 HPLC chromatograms of nicousamide's related substance A.Decomposed by heating；B.Decomposed by acid；C.Decomposed by alkali；D.Decomposed by oxidation；E.Decomposed by illumination；F.Decomposed by humidity

2.4 線性與范圍：取硝克柳胺對照品適量，精密稱定，用DMF制成每1mL含硝克柳胺0.02、0.1、0.2、0.4、1.0mg的溶液，依法測定。以硝克柳胺峰面積A為縱坐標，濃度C為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程A=3.58×107C+2.43×105（r=0.999 6），硝克柳胺在0.02～1.0g/L濃度范圍內線性關系良好。

2.5 檢測限與定量限：取硝克柳胺對照品適量，精密稱定，用DMF溶解并稀釋至適當濃度，進樣測定。以信噪比S/N=3為指標，計算硝克柳胺的最低檢測限為0.1ng；以信噪比S/N=10為指標，計算硝克柳胺的最低定量下限為0.33ng。

2.6 精密度試驗

2.6.1 儀器精密度：精密稱取硝克柳胺供試品，用DMF溶解制成每1m l中約含硝克柳胺0.2mg的溶液，連續進樣測定6次，考察系統精密度。按硝克柳胺峰面積計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.09%。

2.6.2 重復性：取同一批號樣品6份，分別按照“2.2”項下方法制成供試品溶液，按上述色譜條件進行測定，含量按外標法計算，有關物質按主成分自身對照法進行計算。結果硝克柳胺的含量為100.1%，有關物質為 0.32%，其 RSD分別為0.22%、0.56%。

2.6.3 中間精密度：取同一批號樣品，由不同分析人員（照“2.2”項下方法）分3d配制硝克柳胺含量和有關物質的供試品溶液及對照溶液，依法進行測定，含量按外標法計算，有關物質按主成分自身對照法進行計算。結果硝克柳胺的含量和有關物質的RSD分別為0.31%、0.61%。

2.7 溶液穩定性：取供試品溶液與對照溶液（照“2.2”項下方法制備）分別于0、2、4、6、8、12h進樣測定，考察主成分峰峰面積和雜質量的穩定性，結果表明硝克柳胺在12h內基本穩定，主峰峰面積的RSD為0.66%，雜質個數為7（不變），雜質總量的RSD為1.3%，基本穩定。

2.8 回收率試驗：取硝克柳胺對照品適量，按“2.2”項下方法分別配制對照品溶液濃度80%、100%、120%的低、中、高濃度溶液各3份，另取硝克柳胺對照品溶液，分別進樣，記錄色譜圖。結果3個濃度樣品的平均回收率分別為99.78%、100.3%和100.2%，RSD分別為0.11%、0.28%和0.24%。

2.9 樣品測定：分別取硝克柳胺對照品溶液和供試品溶液，進樣測定，按外標法以峰面積計算含量，見表1。

取供試品溶液、自身對照溶液，分別進樣測定，記錄色譜圖至硝克柳胺主峰保留時間的2倍，用自身對照法計算3批樣品有關物質，見表1。

表1 硝克柳胺含量及有關物質測定結果Table 1 Determ ination results of nicousam ide and its related substances（%）

3 討 論

3.1 檢測波長的選擇：對硝克柳胺進行紫外掃描，結果顯示，其最大吸收波長為330nm，考慮到有關物質檢測通常所用的特征波長為214nm和254nm，通過試驗比較了這3個波長。用214nm和254nm檢測的雜質有2個，而用330nm檢測的雜質有7個，所檢出雜質峰的面積基本相同。用214nm檢測的雜質少的原因為巨大的溶劑峰掩蓋了雜質峰，而330nm檢測時溶劑峰很小，不影響雜質的檢測。因此，我們選擇了330nm，既能檢出較多雜質，又避免了溶劑峰的干擾。

3.2 色譜條件的選擇：HPLC測定硝克柳胺有關物質的研究過程中，曾嘗試用C8和不同型號、不同填料的C18色譜柱，并對流動相的組成、配比、流速等因素進行了分析篩選，最終確定了本色譜條件。在該色譜系統下，本品合成過程中的2個反應物峰與3個中間體峰均能與主成分峰達到良好的分離，且柱效高、保留時間合適。

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（本文編輯：趙麗潔）

DETERM INATION OF CONTENTSOF NICOUSAM IDE AND RELATED SUBSTANCES BY HPLC

WANG Le1，WANG Yali2，ZHAO Yu2，NIU Changqun2，GUO Li3*
（1.Department of Pharmaceutical Engineering，Hebei Chemical&Pharmaceutical College，Shijiazhuang 050026，China；2.New Drug R&D Center，North China Pharmaceutical Corporation，Shijiazhuang 050015，China 3.Department of Pharmacy，the Fourth Hospital of HebeiMedical University，Hebei Province，Shijiazhuang 050011，China）

Objective To establish an high performance liquid chromatography（HPLC）method for determination of nicousamide and its related substances.M ethods The separation was performed on an Inertsil C8（250mm×4.6mm，5μm，GL Sciences Inc.）column with the mobile phase consisting of water-acetonitrile-tetrahydrofuran（50∶50∶1）（including 0.1%phosphoric acid）at the flow rate of 1.0mL/min.The detection wavelength was set at 330nm.The column temperature was 30℃.Results

nicousamide；chromatography，high pressure liquid；research design

R917

A

1007-3205（2013）03-0302-04

2012-12-04；

2013-01-17

王樂（1978-），男，河北保定人，河北化工醫藥職業技術學院講師，醫學碩士，從事藥物制劑及質量控制研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.03.019

Under the above conditions，themain peak and the peaks of the related substances were separated quite well.Nicousamide had a good linear relationship（r=0.999 6）within the range of 0.02-1.0g/L.The average recovery（n=9）was 100.1%.The limit of detection was 0.1ng.Conclusion Themethod is sensitive，specific and simple.It can be used for determinating nicousamide and its related substances.