全自動(dòng)革蘭染色儀應(yīng)用效果評(píng)價(jià)

黎 敏，張峰領(lǐng)，王浚霽，臧 婉，周道紅，王 藝，魯衛(wèi)平

（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所檢驗(yàn)科，重慶400042）

革蘭染色是臨床微生物檢驗(yàn)工作中最常用也是最基本的技術(shù)，在細(xì)菌學(xué)的形態(tài)鑒定、分類和用藥選擇有重要的作用［1-2］。目前革蘭染色主要是靠人工操作，需要訓(xùn)練有素的人員，而人工操作受人為因素影響大，重復(fù)性差，不易做到標(biāo)準(zhǔn)化，且工作效率低。PREVI Color Gram全自動(dòng)染色儀是一套適用于所有類型標(biāo)本的自動(dòng)化革蘭染色儀，完全由電腦控制自動(dòng)完成，操作簡便安全［3-5］。可很好地避免外界因素的影響，可大大減少實(shí)驗(yàn)室人員勞動(dòng)強(qiáng)度，增加檢測的準(zhǔn)確度，提高革蘭染色的標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制水平。

1 材料與方法

1.1 菌株 （1）本實(shí)驗(yàn)室保存的參考菌株30株，其中革蘭陽性菌10株，革蘭陰性菌15株，真菌5株。（2）臨床分離菌株50株，其中革蘭陽性菌20株，革蘭陰性菌25株，酵母菌5株。（3）170份臨床樣本采集而得，包括痰液45份，陰道分泌物45份，血液及無菌體液陽性標(biāo)本30份，傷口分泌物20份，糞便10份，尿液20份。（4）質(zhì)控菌株：金黃色葡萄球菌ATCC25923，糞腸球菌ATCC29212，大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853，白色念珠菌ATCC100231。

1.2 主要儀器與試劑 全自動(dòng)PREVI Color Gram染色儀及配套染色試劑（法國生物梅里埃公司），手工法染色試劑（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 涂片制備 所有待檢菌株均接種于血瓊脂培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)18～24h。在生物安全柜中，于潔凈載物玻片上滴加1滴無菌生理鹽水，再用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落少許，于鹽水中混勻。臨床樣本用無菌棉簽或接種環(huán)沾取標(biāo)本直接均勻涂在玻片上。涂好的玻片在生物安全柜中用紫外線燈照射30min。

1.3.2 革蘭染色 分別用于手工染色法和自動(dòng)化革蘭染色儀進(jìn)行染色。

1.4 結(jié)果判定 在顯微鏡下進(jìn)行觀測（油浸物鏡，放大1 000倍）；革蘭陽性微生物呈現(xiàn)紫色；革蘭陰性微生物呈現(xiàn)紅色；酵母菌呈現(xiàn)紫色。在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，細(xì)胞清晰，胞核胞質(zhì)對比強(qiáng)烈，胞內(nèi)吞噬體清晰易辨，細(xì)菌染色特征典型，染料雜質(zhì)少，判斷為合格。而細(xì)胞及胞核胞質(zhì)、胞內(nèi)吞噬體模糊，細(xì)菌染色特征不易辨認(rèn)，染料雜質(zhì)多，判斷為不合格。記錄兩種染色方法的合格率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 非復(fù)雜標(biāo)本的染色結(jié)果 130份，包括參考菌株30株，臨床分離菌50株，血液及無菌體液陽性標(biāo)本30份，尿液20份。自動(dòng)化革蘭染色合格率97.0%，手工染色合格率91.5%，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 復(fù)雜標(biāo)本的染色結(jié)果 120份，包括痰液45份，陰道分泌物45份，傷口分泌物20份，糞便10份。自動(dòng)化革蘭染色合格率87.5%，手工染色合格率68.3%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 染色時(shí)間比較 比較分別連續(xù)涂片12、24、36張，兩種染色方法染色時(shí)間。如圖1所示，隨著標(biāo)本量不斷增加，全自動(dòng)染色系統(tǒng)染色法相比手工染色比較，消耗的時(shí)間明顯減少。

圖1 手工法和自動(dòng)法染色時(shí)間對比圖

3 討 論

革蘭染色常規(guī)手工操作中，由于實(shí)驗(yàn)人員操作手法的不同，涂片滴加試劑的量不定，染色時(shí)間不易恒定，每步洗脫后殘留的洗脫液會(huì)稀釋下一步的染料濃度，造成染色效果出現(xiàn)差異。自動(dòng)化染色儀操作簡便安全，在電腦的操控下，可精確地定量泵出及嚴(yán)格控制滴加的試劑量，每步洗脫后通過離心甩干洗脫液，可避免下一步染料被稀釋，從而避免手工操作的誤差，確保結(jié)果的穩(wěn)定性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對于純菌落以及菌種相對單一的非復(fù)雜標(biāo)本（如：血液、無菌體液陽性標(biāo)本、尿液等），自動(dòng)染色與手工染色相比，兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.063），因此，對于這類涂片，儀器法并沒有表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。對于細(xì)菌成分較為復(fù)雜的臨床標(biāo)本（如：痰液、陰道分泌物、傷口分泌物、糞便等），儀器染色和手工染色的合格率分別為87.5%和68.3%，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），因此對于細(xì)菌成分相對復(fù)雜，且含有大量的人體細(xì)胞和胞外基質(zhì)分子的樣本，儀器染色效果明顯優(yōu)于手工染色。

革蘭染色儀采用高通量設(shè)計(jì)，每小時(shí)可以處理120～300張涂片，從染色時(shí)間對比結(jié)果顯示，隨著樣本量的不斷增加，儀器法所需染色時(shí)間明顯少于手工法，大大降低勞動(dòng)強(qiáng)度。此外，革蘭染色儀只需手工加載涂片，其余無需人工介入；操作完成后涂片已干燥，可直接鏡檢；封閉系統(tǒng)，不污染試驗(yàn)室環(huán)境；顯著節(jié)約試劑用量，更經(jīng)濟(jì)；產(chǎn)生更少廢液，更環(huán)保［6-7］。

本研究所用的菌株和臨床樣品，涵蓋了臨床常見的革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、酵母菌和臨床常見的涂片染色檢查樣本，因此能夠有效地評(píng)價(jià)革蘭染色儀在臨床檢測中的應(yīng)用［8-11］。本研究表明PREVI Color Gram染色儀是一種適合各種標(biāo)本涂片的自動(dòng)化革蘭染色系統(tǒng)，在縮短人力資源的同時(shí)，可以提供快速、標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯著提高結(jié)果的重復(fù)性、可靠性。

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