氧化石墨烯對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物活性的影響

王 潔 劉加強(qiáng) 房 兵 王羽希 楊 志

氧化石墨烯對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物活性的影響

王 潔 劉加強(qiáng) 房 兵 王羽希 楊 志

目的探討氧化石墨烯對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。方法采用改良Hummers法制備氧化石墨烯，將不同濃度的氧化石墨烯溶液與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖和形態(tài)的影響，相關(guān)結(jié)果采用SAS V8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果經(jīng)表征分析，改良Hummers法可以成功制備出高純度的氧化石墨烯。在細(xì)胞密度較低時(shí)，氧化石墨烯對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的分裂增殖有抑制作用；而在細(xì)胞密度較高，達(dá)到生長(zhǎng)接觸抑制的濃度時(shí)，氧化石墨烯具有促進(jìn)細(xì)胞死亡，降低活性細(xì)胞數(shù)量的作用。連續(xù)鏡下觀察后發(fā)現(xiàn)，氧化石墨烯對(duì)細(xì)胞形態(tài)有顯著影響，可使細(xì)胞伸展性下降，折光率降低。這些細(xì)胞形態(tài)的變化與氧化石墨烯的濃度呈正相關(guān)。結(jié)論氧化石墨烯可抑制大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)活性，其作用呈濃度依賴性。

氧化石墨烯大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)活性

石墨烯（Graphene）是一類單原子層二維原子晶體，于2004年首次從石墨中分離獲得[1]，其豐富而優(yōu)異的電學(xué)、力學(xué)和熱學(xué)性能[2]使其成為近年來納米材料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較多的石墨烯衍生物之一，運(yùn)用Hummer方法[3]，由石墨經(jīng)化學(xué)氧化、過濾提純和超聲分散等步驟制備獲得[4]。GO表面帶有大量含氧活性基團(tuán)，具有良好的生物相容性，并有利于對(duì)其表面進(jìn)行化學(xué)功能化修飾。根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，GO具有促細(xì)胞黏附和促細(xì)胞因子聚集的作用，并能夠介導(dǎo)干細(xì)胞定向分化，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用前景[5]。本研究旨在探討GO對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

石墨（500目，青島天元石墨公司）；硝酸鈉、高錳酸鉀、過氧化氫、氯化鋇、硝酸銀（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；α-MEM培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國(guó)）；胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco公司，美國(guó)），CCK-8試劑盒（Dojindo公司，日本）；單克隆抗體CD-29PE、CD44PE、CD45PE、CD90PE（eBioscience公司，美國(guó)）。其余生化試劑都為進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

原子力顯微鏡（Veeco公司，美國(guó)）；透射電子顯微鏡（JEOL公司，日本）；CO2恒溫孵箱（ThermoForma公司，美國(guó)）；ELx800uv型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Bio-Tek公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 GO的制備與鑒定

GO由改良Hummers法制備獲得。制備方法如下：將2 g石墨與50 m L濃硫酸于250 m L燒瓶中混合后強(qiáng)力攪拌30 min，加入5 g無水硝酸鈉（NaNO3），將混合物冰浴冷卻至0°C以下，繼續(xù)攪拌2 h，1 h內(nèi)分三次緩慢加入7.3 g高錳酸鉀（KMnO4），體系溫度因反應(yīng)上升至35℃。反應(yīng)持續(xù)2 h后，用0.2 L冰水和7 mL 30%過氧化氫（H2O2）將反應(yīng)淬滅。合成的GO用3%HCl溶液清洗、過濾，直至BaCl2溶液中無BaSO4沉淀析出。用水進(jìn)一步洗滌，確保氯化物檢測(cè)中AgNO3顯示陰性。最后，將產(chǎn)物放入真空干燥箱，40℃下烘24 h，得到GO樣品。

1.2.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定

將兩只3周齡SD大鼠（由上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）脫頸處死后，75%乙醇浸泡15 min。于無菌條件下逐層切開皮膚、皮下組織，分離肌肉組織，取出大鼠股骨、脛骨、橈骨和肱骨，剔凈肌肉組織。剪碎骨組織放入離心管，加入含雙抗（100 U/m L青霉素、100μg/m L鏈霉素）、10% FBS的α-MEM培養(yǎng)基，反復(fù)吹打至骨片發(fā)白為止，用40μm細(xì)胞篩網(wǎng)進(jìn)行過濾。所獲的細(xì)胞懸液接種于T75培養(yǎng)瓶中，恒溫孵箱（5%CO2、100%濕度、37℃恒溫）中培養(yǎng)，每3天更換一次培養(yǎng)液。密切觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，細(xì)胞達(dá)到80%以上融合時(shí)，用2.5 g/L的胰酶消化，按1∶3傳代培養(yǎng)。取3～4代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志抗原的表達(dá)，對(duì)大鼠BMSCs進(jìn)行鑒定。取第2代BMSCs，0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌細(xì)胞3次，細(xì)胞計(jì)數(shù)，每上機(jī)樣本細(xì)胞量約為5×106個(gè)。每管樣品用500μL PBS重懸細(xì)胞，分別加入單克隆抗體CD29PE、CD44PE、CD45PE和CD90PE，每管樣品設(shè)置同型陰性對(duì)照，室溫避光孵育45 min，PBS洗滌細(xì)胞1次以去除未結(jié)合抗體，300μL PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

實(shí)驗(yàn)共分8組。將GO超聲振蕩溶解于去離子水，配置成濃度為10 mg/m L的儲(chǔ)存液。實(shí)驗(yàn)組GO濃度為0μg/m L（對(duì)照組）、3.125μg/m L、6.25μg/m L、12.5μg/m L、25μg/m L、50μg/m L、100μg/m L的α-MEM對(duì)大鼠BMSCs進(jìn)行培養(yǎng)。另設(shè)單純培養(yǎng)基孔為空白對(duì)照。

1.2.4 GO對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響（CCK-8法）

1.2.4.1 高細(xì)胞密度

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代BMSCs，以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μL培養(yǎng)基。接種好的96孔培養(yǎng)板置于恒溫孵箱（5%CO2、100%濕度、37℃恒溫）中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后分別加入終濃度為0μg/mL、3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的GO培養(yǎng)基對(duì)大鼠BMSCs進(jìn)行培養(yǎng)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別在加藥后0～4 d，隨機(jī)取出一塊96孔培養(yǎng)板進(jìn)行CCK-8檢測(cè)。為排除GO對(duì)吸光度可能的影響，加入CCK-8試劑前先用PBS洗滌2遍并更換新鮮培養(yǎng)基，再加入10μL/孔的CCK-8試劑，充分混勻。置于恒溫孵箱中繼續(xù)孵育2 h后，在推薦波長(zhǎng)450 nm下測(cè)定吸光度（OD），另設(shè)波長(zhǎng)630 nm為參考波長(zhǎng)。以時(shí)間為橫軸，OD值為縱軸繪制曲線。

1.2.4.2 低細(xì)胞密度

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代BMSCs，以2×103個(gè)/孔的密度，按GO濃度梯度依次接種于96孔培養(yǎng)板中。實(shí)驗(yàn)方法同1.2.4.1。

1.2.5 GO對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)的影響

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代BMSCs，以1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，24 h細(xì)胞貼壁后，分別加入終濃度為3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的含GO培養(yǎng)基，進(jìn)行連續(xù)鏡下觀察。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SAS V8軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GO的檢測(cè)鑒定

本實(shí)驗(yàn)中GO采用改良Hummers方法[3]制備，我們的前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)進(jìn)行了報(bào)道[6～8]。原子力顯微鏡照片可以看出，石墨烯純度很高，呈片層結(jié)構(gòu)。由其高度分布圖可知，本實(shí)驗(yàn)制得的氧化石墨厚度約為1.2 nm，與文獻(xiàn)報(bào)道的單層氧化石墨高度接近[9]。由此說明，我們通過改良Hummers法所得到的氧化石墨烯為單層結(jié)構(gòu)。透射電子顯微鏡照片可以看出氧化石墨烯呈薄片結(jié)構(gòu)，邊緣有些卷曲，這種卷曲可能是由于引入了大量含氧官能團(tuán)，造成邊緣區(qū)域大量缺陷的存在，而邊緣區(qū)域由于極大的活性需要通過卷曲來維持系統(tǒng)能量的穩(wěn)定（圖1）。

2.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

大鼠BMSCs原代細(xì)胞接種72 h后首次換液，去除部分不貼壁細(xì)胞。3 d后再次換液，非黏附細(xì)胞基本被去除。約1周后BMSCs可形成明顯的細(xì)胞克隆，經(jīng)分離純化至第3～4代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)趨于一致，呈多角形或長(zhǎng)梭形，折光率高，且增殖活力較強(qiáng)。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)的第2代大鼠BMSCs均一表達(dá)CD29、CD44和CD90，陽性率分別達(dá)到99.98%、99.71%和96.71%，顯示間充質(zhì)干細(xì)胞特性，而造血干細(xì)胞表面標(biāo)志抗原CD45則接近陰性，陽性率為7.83%。傳代能進(jìn)一步純化細(xì)胞，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用第3～5代大鼠BMSCs（圖2）。

2.3 不同細(xì)胞密度下GO對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響

在細(xì)胞密度較高、達(dá)到接觸抑制時(shí)，低濃度的GO對(duì)大鼠BMSCs數(shù)量無顯著影響，細(xì)胞數(shù)量維持在穩(wěn)定和緩慢增長(zhǎng)的狀態(tài)；當(dāng)GO濃度增至25μg/m L，活性細(xì)胞的數(shù)量在加藥1 d后即出現(xiàn)顯著降低。當(dāng)GO濃度繼續(xù)增至50和100μg/mL時(shí)，其促進(jìn)細(xì)胞死亡的作用更為明顯，且具有時(shí)間依賴性，即隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，活性細(xì)胞的數(shù)量越少。結(jié)果說明，在細(xì)胞密度較高時(shí)，低濃度GO（≤12.5μg/mL）對(duì)細(xì)胞無明顯毒性，但高濃度GO（≥25μg/mL）具有較明顯的細(xì)胞毒性（圖3）。

在細(xì)胞密度較低時(shí)，較低濃度的GO對(duì)大鼠BMSCs的分裂增殖能夠產(chǎn)生抑制作用，且具有濃度依賴性，即GO濃度越高，對(duì)BMSCs的增殖抑制就越明顯。盡管細(xì)胞增殖受到GO抑制，但各分組（除100μg/mL濃度組）在加藥2 d后均出現(xiàn)峰值，隨后逐漸降低。以上結(jié)果說明GO抑制細(xì)胞增殖（圖4）。

2.4 倒置顯微鏡連續(xù)觀察

通過對(duì)加藥后BMSCs的連續(xù)觀察后發(fā)現(xiàn)，不同濃度的GO組鏡下均可見GO顆粒，約為10～150μm不等，呈顆粒狀零散分布，并可觀察到部分顆粒在早期（加藥后1～2 d）即在細(xì)胞中沉積。在3.125μg/mL、6.25μg/mL和12.5μg/mL低濃度GO下，細(xì)胞呈多角形或長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)，沒有出現(xiàn)大批死亡的現(xiàn)象，細(xì)胞折光度好，與對(duì)照組無明顯差異。而在25μg/mL和50μg/mL較高濃度時(shí)，大鼠BMSCs形態(tài)較對(duì)照組及低濃度組而言老化明顯，活性細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞伸展性和折光度變差，形態(tài)發(fā)生皺縮或呈扁平狀，立體感消失。此外，在加藥后3 d和4 d，GO顆粒發(fā)生聚積，細(xì)胞進(jìn)一步皺縮或老化，并可見漂浮的死細(xì)胞。而在低GO濃度下，細(xì)胞能保持良好形態(tài)。

綜上所述，通過連續(xù)鏡下觀察后發(fā)現(xiàn)，低濃度GO對(duì)細(xì)胞形態(tài)影響不明顯，高濃度GO對(duì)細(xì)胞形態(tài)有顯著影響，且細(xì)胞形態(tài)與GO濃度和處理時(shí)間呈正相關(guān)（圖5、6）。

圖1 氧化石墨烯的表征。Fig.1 The characterization of GO

圖2 大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)Fig.2 Expression of surface markers of rat bone mesenchymal stem cells

圖3 高細(xì)胞密度下，不同濃度GO處理后大鼠BMSCs增殖曲線Fig.3 The growth curve of rat BMSCs co-cultured with different doses of GO under high cell density

圖4 低細(xì)胞密度下，不同濃度GO處理后大鼠BMSCs增殖曲線Fig.4 The growth curve of rat BMSCs co-cultured with different doses of GO under low cell density

圖5 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察Fig.5 Morphological observation of rat BMSCs

圖6 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察Fig.6 Morphological observation of rat BMSCs

3 討論

GO作為一種具有獨(dú)特理化性質(zhì)的新型納米材料，已成為物理及材料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，而在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用才剛剛起步。GO含大量含氧活性基團(tuán)，具有超強(qiáng)的吸附力和良好的生物相容性，可發(fā)生多種共價(jià)反應(yīng)和非共價(jià)反應(yīng)，而且能對(duì)其進(jìn)行功能化修飾，在載藥、緩釋、靶向治療和生物檢測(cè)方面具有廣泛的應(yīng)用前景[10]。目前，有關(guān)GO體外細(xì)胞毒性的研究甚少。較為一致的觀點(diǎn)是，GO對(duì)細(xì)菌有毒性作用，但對(duì)細(xì)胞有無毒性及毒性的臨界濃度意見不一。目前，GO對(duì)細(xì)胞影響的研究主要集中在其理化性質(zhì)（如粒徑大小、表面電荷、微粒形態(tài)、表面功能基團(tuán)等）對(duì)細(xì)胞毒性的影響[11]。Liao等研究GO和G對(duì)紅細(xì)胞和人皮膚成纖維細(xì)胞的毒性作用后發(fā)現(xiàn)，其粒徑越小，溶血能力越強(qiáng)[12]。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，GO和G對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞的毒性作用具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性。當(dāng)GO濃度低于20μg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞無明顯毒性，當(dāng)濃度大于50μg/mL時(shí)表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，細(xì)胞存活率下降并出現(xiàn)凋亡。此結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。而Chang等通過觀察濃度在10～200μg/mL的GO對(duì)人肺癌上皮細(xì)胞系A(chǔ)549的體外毒性后發(fā)現(xiàn)，GO對(duì)人肺癌上皮細(xì)胞系A(chǔ)549毒性微弱，即使最高濃度組（200μg/mL）也能觀察到細(xì)胞存活率達(dá)80%[14]。

本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)GO的制備及兩種細(xì)胞密度下大鼠BMSCs對(duì)GO的生物學(xué)反應(yīng)進(jìn)行研究。改良Hummers法是最為常用的GO制備方法[3]，此法能獲得官能團(tuán)豐富、水溶性良好的GO，純度高，厚度僅1.2 nm，為單層結(jié)構(gòu)，制備過程安全、簡(jiǎn)便且價(jià)廉，為GO的生物學(xué)應(yīng)用創(chuàng)造了良好條件[6，8，15-16]。本實(shí)驗(yàn)在兩種細(xì)胞密度下通過檢測(cè)GO對(duì)大鼠BMSCs增殖的影響后發(fā)現(xiàn)，GO能明顯抑制BMSCs增殖，且呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。當(dāng)GO濃度≤12.5μg/mL時(shí)，細(xì)胞數(shù)量無明顯變化；當(dāng)GO濃度＞12.5μg/mL時(shí)，活細(xì)胞數(shù)量顯著降低。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，表明GO能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。之后通過對(duì)細(xì)胞形態(tài)的連續(xù)鏡下觀察，也印證了該結(jié)果。在加入GO后1 d和2 d，在低濃度GO組（3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL）中，大鼠BMSCs細(xì)胞形態(tài)呈多角形或長(zhǎng)梭形，折光性好，未觀察到細(xì)胞皺縮、裂解等現(xiàn)象，與對(duì)照組類似；在高濃度GO組（25和50μg/mL）中，細(xì)胞在早期即出現(xiàn)老化表現(xiàn)，細(xì)胞立體感逐漸消失，呈現(xiàn)扁平狀，折光性變差，形狀趨向多樣，且漂浮的死細(xì)胞明顯增多。在加入GO后3 d和4 d，高濃度GO可致細(xì)胞進(jìn)一步老化、凋亡，細(xì)胞毒性作用明顯強(qiáng)于對(duì)照組和低濃度GO組，但是低濃度GO組細(xì)胞在相同條件下能夠保持良好形態(tài)。因此，我們有理由認(rèn)為，12.5μg/mL是氧化石墨烯細(xì)胞毒性的臨界濃度，當(dāng)濃度大于12.5μg/mL時(shí)可觀察到明顯的細(xì)胞毒性，且與氧化石墨烯劑量和作用時(shí)間呈正相關(guān)。

綜上所述，氧化石墨烯可以抑制大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)活性，其作用呈濃度依賴性。將其應(yīng)用到組織工程和再生醫(yī)學(xué)前，需明確其細(xì)胞毒性及機(jī)制。若能通過某些功能化處理降低氧化石墨烯的細(xì)胞毒性，將有助于其在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。

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Preparation of Graphene Oxide and Its Effect on Biological Activity of Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

WANG Jie1,LIU Jiaqiang1,FANG Bing1,WANG Yuxi2,YANG Zhi2.1 Department of Crania&Oral Maxillo-facial Science, Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2 Key Laboratory for Thin Film and Microfabrication of Ministry of Education,Research Institute of Micro/Nano Science and Technology,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200240,China.Corresponding author:FANG Bing(E-mail: braces_dr@hotmail.com);YANG Zhi(E-mail:zhiyang@sjtu.edu.cn).

ObjectiveTo explore the influences of grapheme oxide(GO)on the biological activity of rat bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)in vitro.MethodsGraphene oxide was prepared by the modified Hummers method.The GO suspension with different concentration was co-cultured with rat BMSCs and then the effects of GO on cell proliferation and morphological change were investigated.The obtained data was statistically analyzed by SAS V8.ResultsIt was shown that highly purified GO could be prepared by the modified Hummers method by atomic force microscope and transmission electron microscope.It was found that GO could inhibit the proliferation of rat BMSCs with low density.When cell density was high,BMSCs reached the concentration of contact inhibition,GO could increase cell death resulting of the reduction of the living cells.Through continuous microscopy observation,it was discovered that GO had obvious impacts on cell morphology.The extensibility and refractivity of rat BMSCs were positively correlated with the concentration of GO.ConclusionGO can inhibit the biological activity of rat BMSCs with dose dependence.

Graphene Oxide;Rat bone marrow mesenchymal stem cells;Biological activity

Q813.1+1

A

1673－0364（2013）06－0306－06

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.06.002

上海科委基礎(chǔ)研究領(lǐng)域重點(diǎn)項(xiàng)目（12JC1405700）；上海交通大學(xué)醫(yī)工交叉研究基金（YG2012MS40）；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃資助項(xiàng)目（NCET-12-0356）；上海高校特聘教授（東方學(xué)者）崗位計(jì)劃資助項(xiàng)目。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔顱頜面科（王潔，劉加強(qiáng)，房兵）；200240上海市上海交通大學(xué)微納科學(xué)技術(shù)研究院，薄膜與微細(xì)技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（王羽希，楊志）。

房兵（E-mail：braces_dr@hotmail.com）；楊志（E-mail：zhiyang@sjtu.edu.cn）。