大鼠牙髓干細胞、外胚間充質干細胞的細胞表型的實驗研究

王亦菁 張曉東 于 華 金 巖

大鼠牙髓干細胞、外胚間充質干細胞的細胞表型的實驗研究

王亦菁 張曉東 于 華 金 巖

目的檢測組織特異性分化標記在大鼠牙髓干細胞（DPSC）、外胚間充質干細胞（EMSC）及骨髓間充質干細胞（BMSC）中的表達，探討三者細胞表型的異同。方法通過免疫組化檢測大鼠DPSC、EMSC、BMSC三種細胞的表型；RT-PCR檢測DPSC、EMSC、BMSC的DSPP mRNA表達。結果免疫組化結果顯示，三種細胞對于不同細胞的表面標志有不同程度的表達；RT-PCR顯示，DSPP的mRNA在大鼠DPSC、EMSC中不表達，在BMSC中弱表達。結論DPSC與EMSC的細胞表型具有一定的相關性和延續性。

牙髓干細胞外胚間充質干細胞骨髓間充質干細胞細胞表型

外胚間充質干細胞（Ecto-mesenchymal stem cells，EMSC）來源于神經嵴干細胞（Cranial neural crest stem cells，CNCSC），周澤淵等[1]的研究表明，二者的基因表達譜具有延續演變性。來源于外胚間充質的牙髓組織中包含的牙髓干細胞（Dental pulp stem cells，DPSC）與EMSC之間的基因和蛋白表達模式的異同，是理解牙齒發生過程的中樞環節，對于揭示干細胞的遷移，闡明干細胞的來源具有重要意義。目前由于缺乏對前成牙本質細胞群特異性標志的認識，無法對DPSC進行準確定位。本實驗通過免疫組化和RT-PCR檢測一些組織特異性分化標記（HNK-1是EMSC特異的標記分子之一）在大鼠DPSC、EMSC、BMSC中的表達，分析三種細胞表型的異同，為研究DPSC、EMSC的關系，揭示DPSC的來源，尋找DPSC的特異性標記提供線索。

目前，普遍通過干細胞的表面標志來區分和鑒定各種干細胞，主要是利用熒光素或酶的化學特性與細胞表面受體獨特的結構相結合的方法來鑒別干細胞群。不同組織的干細胞具有自身的特性及特異的表面標志，DPSC、EMSC的表型分析將有助于了解二者在發育演變過程中的相關性，為揭示DPSC的來源提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

高速低溫離心機（SIGMA-1K15）、Peltier Thermal Cycler PTC-100 PCR儀（MJ Research），數碼凝膠成像和分析系統（Biolmaging systems GDS-800），核酸及蛋白定量儀（Biophotometer），ZDY2A電泳儀（南京）。

ExTaq DNA聚合酶、DL2000 DNA marker、10× DNA上樣緩沖液（Takara，日本）；Trizol、superscriptTM II反轉錄酶（Invitrogen，美國）；PolyAT-tractR System（Promega，美國）；引物合成（上海生工）；LSAB加強型免疫組化試劑盒（DAKO，美國）；DAB顯色系統（武漢博士德公司）。

抗基質蛋白-1單克隆抗體（STRO-1，R&D，美國）、抗波形絲蛋白多克隆抗體（VIM，DAKO，美國）、抗成纖維細胞生長因子多克隆抗體（FGF，DAKO，美國）、抗第Ⅷ因子多克隆抗體（DAKO，美國）、抗α-平滑肌肌動蛋白單抗（α-SMA，Sigma，美國）、抗S-100多克隆抗體（DAKO，美國）、抗膠質纖維酸性蛋白多克隆抗體（GFAP，DAKO，美國）、抗Nestin單抗（DAKO，美國）、抗LNGFR/P75多抗（Santz Cruz，美國）、抗EMA單克隆抗體（DAKO，美國）、抗LA多克隆抗體（DAKO，美國）、抗CD14單克隆抗體（DAKO，美國）、抗牙本質涎蛋白多克隆抗體（DSP，Santz Cruz，美國）、抗牙本質基質蛋白多克隆抗體（DMP，Santz Cruz，美國）；抗骨涎蛋白（BSP）、抗骨基質蛋白（BMP）、抗骨橋素（OPN）、抗Ⅰ型膠原、抗Ⅲ型膠原、抗Ⅱ型膠原多克隆抗體（L.Fisher饋贈）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

將DPSC、EMSC、BMSC原代培養，細胞懸液以1×104個/孔的細胞密度接種于6孔板，常規培養，鏡下觀察培養板中細胞克隆情況，用于實驗。

1.2.2 DPSC、EMSC、BMSC細胞表型免疫組化鑒定

將三種細胞各取2株克隆，接種于預先消毒處理過的小蓋玻片（8 mm×8 mm）上，37℃孵育24 h，0.1 mol/L PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定30 min，經梯度乙醇至水。按照LSAB加強型免疫組化試劑盒說明書進行細胞的免疫組化染色。

1.2.3 RT-PCR檢測DPSC、EMSC、BMSC的DSPP mRNA表達

提取DPSC、EMSC、BMSC總RNA；

引物合成：按照Genbank登陸的基因DSPPm-RNA序列及引物設計原則，設計如下：片段長度為464 bp。①5'-AGACACGGGTTCTGGTGATGGT-3'；②5'-CCCTTGCTTTGGGCTATTCCTT-3'。

RT-PCR反應體系：10×PCRbuffer5μL，25 pmol/μL引物1μL，cDNA模板2μL，10 mmol/L dNTP 1μL，ExTaq DNA聚合酶0.5μL，加水至50μL。反應條件：94℃預變性2 min，94℃變性45 sec，56℃退火45 sec，72℃延伸60 sec，共35個循環，72℃延伸10 min。取PCR產物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RTPCR產物。

2 結果

2.1 細胞表型免疫組化鑒定結果

DAB顯色，陽性結果為程度不等的棕黃色，分別記為++、+、±和-。陰性對照的胞漿和胞膜均無特異性染色（表1）。

2.2 RT-PCR結果

DSPP的mRNA在大鼠DPSC、EMSC中未檢測到，在BMSC中有弱的表達（圖1）。

圖1 RT-PCR檢測DSPP mRNA在DPSC、EMSC、BMSC中的表達Fig.1 The mRNA expression of DSPP in rat DPSC,EMSC and BMSC

表1 大鼠DPSC、BMSC、EMSC細胞表型的免疫組化結果Table 1 The phenotype of rat DPSC,BMSC and EMSC detected by immunohistochemistry

3 討論

免疫組化結果顯示，隨機選取的DPSC克隆株細胞表型呈現多樣性。干細胞具有自身的特性，表達與其來源相關的某些特異性標志[2]，而成纖維細胞廣泛存在于各組織中，并有一定的組織特異性。本組免疫組織化學染色顯示，DPSC強表達間充質干細胞的標志STRO-1，表達成纖維細胞的標志波形絲蛋白，成纖維細胞生長因子，還表達內皮細胞相關標志（如第Ⅷ因子），平滑肌的標志（如α-平滑肌肌動蛋白），弱表達骨標志（如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、骨橋素等）。DPSC不表達軟骨標志Ⅱ型膠原，上皮細胞的標志EMA，淋巴細胞的標志LA，造血細胞的標志CD14。此結果提示，大鼠DPSC同BMSC一樣，同表達間充質來源的組織細胞的特征標志。本組結果與Gronthos等[3]對于人來源的DPSC表型研究的報道相似。李盛琳等[4]也發現體外培養的人DPSC表達骨鈣素、骨涎蛋白、骨連結蛋白和Ⅰ型膠原。另組實驗也觀察到大鼠DPSC的表達譜與人來源的DPSC表達譜相似[5]，表達的強弱有部分差異，可能是種屬間的差異，也可能是操作誤差造成的，需進一步實驗證實。

由于對DPSC的確切來源不甚清楚，因而無法對其進行定位、分離、鑒定。Shi等[6]通過cDNA微陣列分析，比較了人來源DPSC和BMSC的表型差異，發現二者有超過4 000個基因的表達水平是一致的，包括細胞外基質成分、細胞黏附分子、成骨特異性調節的轉錄因子、骨相關的標志分子、調節牙本質和骨形成的生長和分化因子等。對于表達不同的基因，通過RT-PCR、Northern blot等分子生物學方法得以確認，結果顯示18型α-1膠原、胰島素樣生長因子2型（IGF-2）、絡氨酸激酶、NAD(P)-氧化還原酶、細胞周期依賴性蛋白激酶-6（CDK6）在DPSC中高表達，而胰島素樣生長因子連接蛋白-7（IGFBP-7）和Ⅰ型α-2膠原在BMSC中高表達。因為成牙本質細胞的分化與成骨細胞的分化，牙本質和骨的成分均有許多相似之處，本組實驗以BMSC為參照，追蹤研究DPSC的來源，將其與EMSC的特異性細胞表型進行初步分析檢測，結果表明二者的細胞表型具有一定的相關性。已有研究表明EMSC免疫組化抗NSE(+)、NF(+)、Nestin(+)、S-100(+)、GFAP(-)，說明該細胞表達Nestin、NSE、NF等神經特異標志，不表達GFAP神經膠質細胞的標志；抗Vimentin(+)說明該細胞也表達中胚層的特異性標志。因此認為該細胞具有兩個胚層的特點，是一種具有外胚層特征的間充質干細胞[1]。本組結果顯示，DPSC和EMSC都表達神經譜系的標志S-100，而BMSC基本不表達。S-100是神經嵴來源的間充質前體細胞的標志，S-100可以區分口腔顱面部的外胚間充質和來源于中胚層的間充質，其免疫活性的分布可以對外胚間充質的范圍有初步的了解。而神經前體細胞的標志抗HNK-1的著色則較為特別，EMSC細胞均有著色，但著色程度有差別，大部分細胞著色較深，少部分細胞著色較淺，其在DPSC中的表達也較為普遍，但是大部分陽性著色較淺，少部分著色深。HNK-1為遷移中神經嵴細胞的特異性抗體，在其他的中胚層細胞和內、外胚層的細胞中幾乎不表達，因而用抗HNK-1單抗可以將來源于顱神經嵴的EMSC和其他細胞分開，是已確認的遷移的神經嵴細胞的標志[7]。本組結果表明，牙髓組織中存在的DPSC表達EMSC相對特異性的表面標志，提示其極有可能是EMSC在機體發育成熟后殘留于牙髓組織中的細胞成分，但在細胞遷移的過程中細胞的表型有部分變化，表達的量有所差異，可能是部分細胞發生分化造成的。在胚胎發育過程中，成牙本質細胞來源于外胚層間充質，成骨細胞來源于中胚層間充質的中軸和外層骨[8]。本研究中，BMSC也弱表達許多神經譜系的標志，與外胚間充質細胞相似，但BMSC還表達一些成熟的成骨細胞標志，如BMP、BSP等[9]，而EMSC、DPSC卻不表達，提示它們代表著不同的間充質干細胞。

本實驗通過RT-PCR檢測了牙本質特異性蛋白分子DSPP在三種細胞中的表達。結果顯示，大鼠來源的細胞中，BMSC中DSPP有弱表達。已有研究表明，兩種基質蛋白DSP、DPP只表達于牙本質中，二者由單獨的基因DSPP編碼[10-12]。體外實驗表明，DSPP抗體只在成熟的牙本質層細胞中表達。動物模型研究RT-PCR結果顯示，鼠切牙來源的牙乳頭細胞不表達DSPP的mRNA，相反新鮮分離的成牙本質細胞-牙髓組織中檢測到DSPP的高表達[13]。而本組DPSC、EMSC屬于未分化的干細胞群，因此不表達成熟的牙本質特異性蛋白。免疫組化結果表明，大鼠來源的EMSC弱表達DMP。EMSC對于DMP的弱表達可能是由于其中含有一部分已分化的細胞，但在mRNA水平未檢測到。對于大鼠BMSC低表達DSPP的mRNA，有研究報道DSPP表達于骨組織[14]，盡管是低水平表達，仍提示DSPP有可能是一種骨性標志，還需進一步的分析鑒定。

不同胚胎干細胞因來源（胚泡的內細胞群）而定義，而成體干細胞（ASC）非常稀少，起源不很清楚，因此沒有確定的特征含義。目前鑒定ASC是依賴于細胞表面標志，觀察它們在試管和培養皿中的分化模式。因此ASC的來源是干細胞研究的主要內容之一，明確ASC是否是胚胎干細胞的“殘余”還是由其他路徑產生、它與周圍環境的關系如何等等，將有助于了解人體內共有多少種干細胞，它們分別存在于哪些組織器官，它們的組織學表型和生物學功能是如何的。Suzuki等[15]從小鼠胚胎肝臟分離出能夠在體外克隆水平擴增，不僅能產生肝臟和膽管上皮，而且形成胰臟和胃腸道上皮的細胞。表明ASC的前體細胞可能在胚胎發育早期就已存在，依賴于周圍環境而分化為不同于來源組織的細胞。在口腔頜面部發育中，顱神經嵴干細胞（CNCSC）廣泛遷移至胚胎面突外胚間充質的過程中，一部分細胞可以繼續保留干細胞的特性，因此在外胚間充質中也有保留下來的多能干細胞。DPSC這種來源于牙髓組織的ASC是否就是牙髓組織存在的殘余EMSC，對于二者表型的深入分析研究，包括大范圍的基因芯片檢測、細胞的標記追蹤研究、干細胞的克隆分析等將對于揭示DPSC的來源及其定位鑒定具有重要意義。

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Phenotype of Rat Dental Pulp Stem Cell and Ectomesenchymal Stem Cell

WANG Yijing1,ZHANG Xiaodong1,YU Hua1,JIN Yan2.1 Department of Stomatology,The General Hospital of Shenyang Military Region,Shenyang 110840,China;2 School of Stomatology,Fourth Military Medical Hospital,Xi'an 710032,China.Corresponding author:WANG Yijing(E-mail: kpaba@sina.com.cn).

ObjectiveTo investigate the expression of special differentiation marker in dental pulp stem cell(DPSC), ectomesenchymal stem cell(EMSC)and bone mesenchymal stem cell(BMSC),to compare the difference of the phenotype among the three kinds of cell.MethodsThe phenotype of rat DPSC,EMSC and BMSC was described by immunohistochemistry.The mRNA expression of DSPP in rat DPSC,EMSC and BMSC was detected by RT-PCR.ResultsImmunohistochemistry showed different degree of expression of cell surface markers in the three kinds of cells.The DSPP mRNA was not detected in rat DPSC and EMSC,but little detected in BMSC by RT-PCR.ConclusionThe special cell phenotypes of rat DPSCs and EMSC were in possession of certain relevance and continuity.

Dental pulp stem cell;Ectomesenchymal stem cell;Bone mesenchymal stem cell;Cell phenotype

Q813.1+1

A

1673－0364（2013）06－0315－04

2013年9月6日；

2013年10月21日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.06.004

110840遼寧省沈陽市沈陽軍區總醫院口腔內科（王亦菁，張曉東，于華）；710032陜西省西安市第四軍醫大學口腔醫學院（金巖）。

王亦菁（E-mail：kpaba@sina.com.cn）。