利用孤雌生殖誘導(dǎo)系誘導(dǎo)單倍體技術(shù)在玉米自交系選育中的應(yīng)用

丁昕穎王俊強(qiáng)黃新育徐艷霞張淑芬付 龍藍(lán) 嵐曹立軍

（1黑龍江省畜牧研究所，齊齊哈爾161005；2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院齊齊哈爾分院，齊齊哈爾161006）

利用孤雌生殖誘導(dǎo)系誘導(dǎo)單倍體技術(shù)在玉米自交系選育中的應(yīng)用

丁昕穎1王俊強(qiáng)2黃新育1徐艷霞1張淑芬1付 龍1藍(lán) 嵐1曹立軍1

（1黑龍江省畜牧研究所，齊齊哈爾161005；2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院齊齊哈爾分院，齊齊哈爾161006）

由于單倍體只具有每一對同源染色體及等位基因中的一個，遺傳基礎(chǔ)單一，單倍體染色體的加倍，相當(dāng)于同質(zhì)結(jié)合，可得到遺傳上穩(wěn)定、純合，性狀不分離的二倍體純系。玉米單倍體育種技術(shù)能有效地提高選育效率，加快育種進(jìn)程。與其他玉米常規(guī)育種選系技術(shù)相比，在自交系純化方面具有不可替代的優(yōu)越性。本文簡要介紹該項技術(shù)在玉米自交系選育中的應(yīng)用過程，為進(jìn)一步科學(xué)有效地利用提供操作依據(jù)。

玉米；誘導(dǎo)；單倍體；自交系；選育

玉米是我國重要的糧飼作物，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的地位。同時，畜牧業(yè)發(fā)展已成為黑龍江省農(nóng)業(yè)發(fā)展的重點，針對畜牧業(yè)快速發(fā)展中優(yōu)質(zhì)飼草飼料缺乏的局面，作為飼草飼料之王的青貯玉米，將成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重點和發(fā)展畜牧尤其是奶產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵點，對黑龍江省農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)有著重要的意義。配合力高、抗逆性強(qiáng)、品質(zhì)優(yōu)、適應(yīng)性廣的優(yōu)良自交系是組配出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、持綠性好的青貯玉米雜交種的基礎(chǔ)。采用適當(dāng)?shù)倪x育策略，有目的地組配群體，從中選育自交系，可以使自交系的產(chǎn)量和其他經(jīng)濟(jì)性狀得以有效地改良。

利用單倍體技術(shù)選育玉米自交系是以孤雌生殖誘導(dǎo)系作父本與基礎(chǔ)材料雜交，使母本產(chǎn)生顯著高于自然頻率的單倍體，產(chǎn)生的單倍體再經(jīng)自交加倍產(chǎn)生雙單倍體，即為新的玉米自交系。理論上只需要2個生育期即可得到二倍體純系，可提高育種效率，特別適合我國目前玉米育種實際的需要。

1 單倍體育種技術(shù)的作用

玉米育種的成功在很大程度上取決于育種方法、可行性、前瞻性和準(zhǔn)確性。玉米新品種的成功選育，其基礎(chǔ)在于如何選育高產(chǎn)、高抗、高特殊配合力的優(yōu)良自交系，是玉米育種的核心部分。玉米單倍體育種技術(shù)在自交系純化方面已逐步成為玉米育種的關(guān)鍵技術(shù)。

利用常規(guī)育種方法獲得純系需要自交5～7代才能使品系達(dá)到基本純合。利用單倍體育種技術(shù)從雜交種到獲得純系只需要2個生育期，所獲得的二倍體純系便可用于雜交種組配，能夠大大提高育種效率，加快育種進(jìn)程。

作為玉米群體改良的主要方法，輪回選擇中也可以充分結(jié)合單倍體技術(shù)。由于單倍體只攜帶一套基因組，不存在顯性基因?qū)﹄[性基因的掩蓋，增加了選擇的準(zhǔn)確性，提高了輪回選擇的效率，同時更有利于發(fā)現(xiàn)隱性突變體。多數(shù)有害基因控制的性狀會導(dǎo)致單倍體種子和植株生活能力下降、高度不育，進(jìn)而實現(xiàn)自然淘汰，而應(yīng)用常規(guī)方法必須要經(jīng)過多輪的選擇才可實現(xiàn)。

2 具體操作

2.1 選擇誘導(dǎo)系 孤雌生殖誘導(dǎo)系可通過雜交誘導(dǎo)使母本產(chǎn)生高于自然頻率的單倍體。宜選擇誘導(dǎo)率高、花粉量大、散粉持續(xù)時間長的誘導(dǎo)系。如國內(nèi)常用的Stock6、RWS、MHI、農(nóng)大高誘1號、吉高誘系3號等。平均單倍體誘導(dǎo)率為2．52%～10．4%[1]。

2.2 選擇基礎(chǔ)材料 基礎(chǔ)材料應(yīng)選擇針對性強(qiáng)、適應(yīng)性廣、抗病抗逆性強(qiáng)、品質(zhì)較好的雜交種、二環(huán)系或群體，更容易獲得優(yōu)良自交系。由于不同血緣的基礎(chǔ)材料的誘導(dǎo)率和加倍率不同，優(yōu)先選擇誘導(dǎo)率和加倍率高的二環(huán)系或群體。要求子粒黃色或白色。

2.3 雜交誘導(dǎo) 種植單倍體地塊需要精細(xì)整地、基肥充裕、水分充足。單倍體誘導(dǎo)系一般生育期較短，盡量選用花期與基礎(chǔ)材料相近的誘導(dǎo)系，或采取分期播種、地膜覆蓋促早熟、延期管理促晚熟等系列措施，以確保花期相遇；一般育種計劃可以6∶1配播誘導(dǎo)系，當(dāng)育種規(guī)模大、基礎(chǔ)材料多時，可采用隔離區(qū)內(nèi)以一父多母（1∶4～5的比例）配播誘導(dǎo)系，以減少人工雜交工作量。

單倍體誘導(dǎo)系與母本材料的雜交授粉與正常雜交相同。極端高溫天氣時授粉時間在11∶00前為好。涼爽季節(jié)，延遲授粉（長花絲≥8cm時）有利于提高單倍體誘導(dǎo)率（提高1．5～2倍）[1]。待果穗完熟后收獲，放置晾曬棚中妥善保管。子粒含水量達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)時脫粒，以減少對子粒的損傷。

2.4 單倍體篩選與鑒定

2.4.1 子粒鑒定方法 根據(jù)誘導(dǎo)系的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，雜交所產(chǎn)生的符合胚乳淀粉層為紫色或褐色、胚芽無色的子粒為單倍體子粒，其余的為非單倍體子粒[2]。

2.4.2 植株田間確認(rèn) 一般在7～8葉期，凡幼苗葉鞘綠色者為單倍體，紫色者為雜交二倍體。另外，單倍體的植株瘦弱、成株矮小（一般是基因型相同的純合二倍體植株高度的70%左右），并且生長緩慢，葉片較少（一般比基因型相同的純合二倍體植株少3～4片）、褶皺、收斂、短三角葉型；雄穗短小、穎殼飽滿、花粉量極少；大多花期不協(xié)調(diào)。

2.4.3 其他輔助鑒定方法 近年來，隨著國內(nèi)外各類研究日益豐富，農(nóng)產(chǎn)品的加工、識別與分級檢測，其在玉米品種識別、品質(zhì)檢測等方面的研究內(nèi)容越來越深入。除根據(jù)常規(guī)的子粒標(biāo)記性狀鑒定單倍體子粒外，還有很多科學(xué)的輔助鑒定方法。如利用農(nóng)大高誘1號及其衍生系作誘導(dǎo)系時，利用改良的核磁共振儀進(jìn)行油分含量單粒測定可以實現(xiàn)機(jī)械化自動挑選。也可利用細(xì)胞遺傳學(xué)方法鑒定植物體細(xì)胞中或減數(shù)分裂細(xì)胞中的染色體數(shù)目，或者從解剖學(xué)方向觀察葉片表皮氣孔、保衛(wèi)細(xì)胞的大小和數(shù)目。還可以用電離射線照射（如X射線）葉片和分子標(biāo)記技術(shù)都能夠簡單而且準(zhǔn)確的鑒定單倍體，但需要一定的設(shè)備和成熟的操作[3]。

此外，在視覺技術(shù)領(lǐng)域，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)研制的玉米分選試驗平臺可完成玉米單倍體種子胚部特征提取及動態(tài)識別，為玉米單倍體快速分選系統(tǒng)的實現(xiàn)提供了有價值的參考和技術(shù)支撐，其對單倍體的識別正確率可達(dá)98．04%，對雜合體的識別正確率為94．44%[4]。

2.5 加倍方法 自然狀態(tài)下單倍體恢復(fù)二倍性是細(xì)胞的一種本能反應(yīng)，大多單倍體植株表現(xiàn)為雌雄不調(diào)，花粉很少，對有些自然加倍率低的材料需要進(jìn)行人工加倍。

2.5.1 自然加倍 玉米品種加倍率在自然條件下很低，遺傳背景是決定單倍體細(xì)胞自然加倍時間和頻率的主要因素。當(dāng)單倍體植株有花藥外露并有明顯花粉產(chǎn)生時，謹(jǐn)慎取其花藥，破開取其花粉，進(jìn)行精細(xì)自交授粉，如次日有花粉應(yīng)進(jìn)行二次授粉，同時嚴(yán)格避免外來花粉污染與蟲媒花粉傳染。

2.5.2 人工加倍 利用化學(xué)藥劑可破壞細(xì)胞有絲分裂的紡錘絲形成，實現(xiàn)染色體加倍。常用的加倍劑有秋水仙素、拿草特、APM、安磺靈和氟樂靈等。主要加倍方法有浸種法、浸根法、浸芽法、注射法、田間噴除草劑和培養(yǎng)基摻入法等[5]。

2.6 雙單倍體（DH系）的確認(rèn)和繁殖 單倍體植株通過自然或人工加倍后所結(jié)子粒長出的植株稱之為雙倍體自交系（DH系），基因高度純合，性狀一致。

選擇土地肥力適中、易于田間管理的地塊，種植獲得的雙單倍體子粒，按穗行精細(xì)播種，確保出苗。另外，如多個子粒來自同一果穗，播種后植株長勢和子粒性狀應(yīng)整齊一致，且不是雜交種株型，即可確認(rèn)為純合的DH自交系。如單株的雙單倍體植株，符合自交系性狀特征且長勢良好，應(yīng)先自交，結(jié)實后于下一生育期按穗行播種、繁殖，如果獲得的植株長勢整齊一致，則即可確認(rèn)為純合的玉米DH自交系[6]。單倍體植株授粉后需精心管理，注意一切外在影響因素，成熟后收獲所得自交系。下一生育期即可進(jìn)行配合力測定，用于組建雜交組合。

3 存在的問題

利用單倍體技術(shù)選育自交系是一種鏈條式工程化育種模式[7]。在玉米育種中有效的應(yīng)用單倍體技術(shù)，需要擴(kuò)大規(guī)模，但以小課題組為單位的研究形式難以成功地利用該技術(shù)，更適合于規(guī)模較大且有實力的育、繁、推一體化的種業(yè)公司使用。從技術(shù)上來說：難點主要在于單倍體發(fā)生的頻率低；重組二倍體時染色體加倍具有一定的困難，而通常使用的人工加倍方法效果不明顯且對植株和環(huán)境都有不同程度的危害，需要探索更有效的加倍方法，提高加倍頻率；不能有效地打破不良基因的連鎖；基因間的重組幾率較低；單倍體種子的鑒定篩選目前主要采用人工方式進(jìn)行篩選，耗時費力且準(zhǔn)確率不高。

另外，由于單倍體基因的隨機(jī)性高，致使加倍后的純合二倍體自交系不一定符合育種目標(biāo)需要，選育成功的幾率不高，需要探索一些輔助方法，在DH系形成之前加大選擇強(qiáng)度，提高DH系的優(yōu)質(zhì)率。

4 發(fā)展前景

國外運用單倍體育種技術(shù)較早、較成熟，許多玉米商業(yè)育種公司已廣泛地利用單倍體育種技術(shù)，并正逐步替代傳統(tǒng)選系方法，以降低育種年限，加快育種速度。近年來隨著國內(nèi)育種水平提高，單倍體育種技術(shù)已被育種單位廣泛運用，并創(chuàng)制出多個遺傳標(biāo)記能力強(qiáng)、誘導(dǎo)率更高的誘導(dǎo)系，許多科研單位和大型種子企業(yè)已在玉米育種工作中應(yīng)用玉米單倍體誘導(dǎo)技術(shù)[8]。

隨著玉米商業(yè)化競爭加劇，種質(zhì)資源的創(chuàng)新利用、創(chuàng)新效率急需提升。單倍體育種技術(shù)與轉(zhuǎn)基因育種相比，不存在生物安全問題，并且周期短、速度快。可以結(jié)合品種設(shè)計、分子育種、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等應(yīng)用于種質(zhì)擴(kuò)增和群體改良等各個可能的領(lǐng)域，為大規(guī)模、快速創(chuàng)制玉米的優(yōu)良DH系種質(zhì)和大量選育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)雜交種提供保障[9]。總之，玉米單倍體育種技術(shù)正迎來前所未有的機(jī)遇與挑戰(zhàn)，應(yīng)用前景將更加廣闊。

[1] 才卓，徐國良，Chang M T，等．玉米單倍體育種研究進(jìn)展[J]．玉米科學(xué)，2008，16（1）：1-5

[2] 馬海林，李繼榮，盧保紅，等．玉米單倍體技術(shù)要點及其在育種中的應(yīng)用展望[J]．農(nóng)學(xué)學(xué)報，2014，4（9）：25-29

[3] 馬駿，姜敏，劉欣芳，等．玉米單倍體育種研究技術(shù)的探討[J]．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，42（10）：135-139

[4] 張俊雄，武占元，宋鵬，等．玉米單倍體種子胚部特征提取及動態(tài)識別方法[J]．農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2013，29（4）：119-203

[5] 姜昱，王玉民，王中偉，等．我國玉米單倍體育種技術(shù)研究進(jìn)展[J]．玉米科學(xué)，2008，16（6）：48-51，57

[6] 才卓，徐國良，任軍，等．玉米雜交誘導(dǎo)單倍生殖選育自交系技術(shù)規(guī)范（修訂版）[J]．玉米科學(xué)，2013，21（1）：1-5

[7] 張如養(yǎng)，段民孝，趙久然，等．單倍體技術(shù)在玉米種質(zhì)改良和育種中的應(yīng)用方向[J]．作物雜志，2012（5）：4-8

[8] 蘆連勇，崔俊明，盧道文，等．玉米單倍體誘導(dǎo)系及其在育種中的應(yīng)用研究[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（9）：5145-5147

[9] 劉俊．孤雌生殖誘導(dǎo)玉米單倍體育種技術(shù)研究[J]．中國種業(yè)，2014（2）：12-14

2016-12-09）