煙草白粉病抗性基因的QTL定位

牟建英 ，錢玉梅，任民，劉艷華，張興偉，王志德，潘應花

1中國農業科學院煙草研究所/國家煙草行業煙草病蟲害監測與綜合治理重點開放實驗室,青島 266101；

2 農業部煙草類作物質量控制重點開放實驗室，青島 266101；

3 中國農業科學院研究生院，北京 100081

煙草白粉病是由二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum DC）侵染引起的煙草主要葉部病害之一。白粉病侵染的葉片在調制過程中病斑會繼續擴大，葉片薄如紙狀，易破碎，缺乏彈性，影響煙葉質量[1]。由于我國大面積種植的烤煙品種均不抗白粉病[1]，化學防治仍是白粉病的主要防治方法，除了增加人力、物力投入，還會引起環境污染等生態問題，培育抗病品種是防治煙草白粉病最為經濟有效的措施。開展抗性基因的QTL定位，對煙草白粉病抗性基因進行分子生物學研究，對于明確煙草白粉病的抗病機理和分子標記輔助選擇育種具有重要意義。

煙草白粉病抗性遺傳規律，以及分子標記輔助選擇育種等方面的研究較少。李華麗等[2]以臺煙7號和白肋21作為雜交親本，后代自交衍生的127個F2和F2:3家系為材料，檢測到1個煙草白粉病加性QTL，貢獻率為11.63%，本文利用2317對SSR引物對煙草白粉病抗性基因進行QTL分析，為煙草抗白粉病分子標記輔助選擇育種和抗白粉病相關基因的克隆奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

母本臺煙7號是抗白粉病品種，父本NC89是感白粉病品種。臺煙7號與NC89雜交得到F1，F1自交得到285株F2單株。接種鑒定病原菌為二孢白粉菌Erysiphe cichoracearum DC。所用實驗材料均來自中國農業科學院煙草研究所。

1.2 煙草白粉病抗性的接種鑒定

對煙草白粉病抗性的苗期鑒定于2012年在中國農業科學院煙草研究所溫室內完成。鑒定材料包括親本、F1、F2，煙苗5-6葉期采用噴霧接種法接種，孢子懸浮液濃度為1.25×107個/mL，接種20天后調查病情。

根據GB/T 23222-2008中煙草白粉病病害嚴重度分級標準，逐株以葉片為單位分級調查。

0級：無病斑；

1級：病斑面積占葉片面積的5%以下；

3級：病斑面積占葉片面積的6%～10%；

5級：病斑面積占葉片面積的11%～20%；

7級：病斑面積占葉片面積的21%～40%；

9級：病斑面積占葉片面積的41%以上。

群體抗性分級標準：

高抗：0≤病情指數≤15；

抗病：15＜病情指數≤35；

中抗：35＜病情指數≤55；

感病：55＜病情指數≤80；

高感：80＜病情指數≤100。

病情指數（DI）：DI=∑（每個病級葉片數×病級數）/（葉片總數×最高病級數）×100。

1.3 DNA提取及SSR體系

DNA提取參照天根生化科技有限公司DNA提取試劑盒提取方法，略有改動。

SSR引物采用2011年Bindler等[3]發布的煙草高密度遺傳連鎖圖譜，共計2317對，由上海生物工程有限公司合成。

PCR反應體系：總體積為10 μL，包括Green Master 2×Mix 5 μL，DNA（30-50 ng·μL-1）1 μL，正反向引物（10 μmol·L-1）各 0.5 μL，ddH2O 3μL。反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，35個循環；72℃延伸7 min，4℃保存。其中退火溫度因序列不同略有調整。擴增產物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠800V恒電壓電泳分離，銀染顯色后用燈箱進行觀察。

1.4 SSR標記篩選、連鎖圖構建與QTL定位

從2317對SSR引物中篩選在兩親本間表現出多態性的引物，并對部分F2單株進行分析，進一步篩選出能擴增出清晰可統計帶型的SSR引物，最后利用得到的SSR引物對285株F2單株進行分析。

用OneMap軟件包對F2群體的SSR標記分型數據進行分析，構建遺傳連鎖圖譜，用MapDraw V2.1[4]繪制遺傳連鎖圖。

利用WinQTLCart2.5 軟件進行QTL分析[5]，利用置換檢測1000次重復，估算基因組范圍內α=0.05水平上的LOD值。本研究中使用的閾值為LOD≥2.5。

2 結果與分析

2.1 煙草白粉病的抗性鑒定結果

母本臺煙7號表現為對白粉病免疫，父本NC89表現為感白粉病，平均病情指數為74.24， F1表現為感白粉病，平均病情指數為76.81， F2表現出抗病性分離，其病情指數分布如圖1。F2群體病情指數基本符合正態分布，可以用于QTL分析。

圖1 F2群體病情指數分布圖

2.2 SSR標記連鎖群的構建

利用親本臺煙7號和NC89對2317對SSR引物進行篩選，共得到112對多態性引物，多態率為4.83%。用篩選出的112對多態性引物對部分F2群體單株DNA進行擴增，選擇61對多態顯著且擴增穩定的SSR引物。用這61對引物對F2群體的285個單株DNA進行擴增，電泳檢測，記錄帶型。

利用OneMap軟件在LOD≥3的條件下構建遺傳連鎖圖譜。該圖譜全長481.8 cm ，包含45個標記位點，標記間平均遺傳距離為10.7 cm 。圖譜共包含15個連鎖群，每個連鎖群平均有3個標記，其中最長連鎖群長64.7 cm ，最短的為5.2 cm 。另外有16個標記未整合到該圖譜上。

2.3 煙草白粉病抗性基因的QTL

利用WinQTLCart2.5 軟件，復合區間作圖法對煙草白粉病抗性QTL進行定位。在14號連鎖群上檢測到1個QTL,暫命名為pm14.1，其加性效應為-14.38，貢獻率為21.02%，LOD值為9.45，為減效位點，增效基因來自于感病的父本NC89。Pm14.1 與引物52725 緊密連鎖，遺傳距離為1.01 cm。

圖2 臺煙7號×NC89 F2群體SSR標記連鎖群的構建及煙草白粉病抗性基因的QTL定位

3 討論

目前，關于煙草白粉病抗性遺傳規律的研究很少，而且結果也不盡一致。主要觀點有：Kokubu品種表現為重復隱性等位基因控制的遺傳[1]；Hicks55、Pobeda3、TB22三個品種的抗性均表現為顯性單基因遺傳[1]；塘蓬抗性表現為隱性基因遺傳[6]。導致不同結果的原因可能有以下幾方面：首先，煙草品種不同，其抗性遺傳機制可能不同；其次，煙草白粉菌種類不同，接種時可能是病菌混合體【瓜單囊殼〔Sphaerotheca fuliginea（Schlecht.）Poll.〕，二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum DC.）】而不是單孢培養物，也會導致不同的鑒定結果；再次，不同研究所采用的抗性鑒定方法及分級標準也不盡一致；最后，環境對白粉病的發生也有較大的影響。而本研究所采用的煙草品種NC89，是我國栽培種植面積較大的品種[7]，選其作為親本可使本研究結果具有較好的代表性。同時，菌種為純化后的單一菌種，接種及發病調查嚴格按照國家標準執行，嚴格控制環境溫濕度。以上措施有效保證了研究結果的可靠性和準確性。

本研究檢測到一個煙草白粉病抗性QTL位點，該位點與SSR標記52725緊密連鎖，遺傳距離為1.01 cm，與李華麗等以往的研究相比，在加性效應上方向相同，均為負值，但貢獻率相差較大。據此可認為兩者為不同的QTL位點。由于數量性狀遺傳在一定程度上受到環境的影響，因此，檢測到的QTL數量及效應可能存在不同程度的差異[8-11]，本研究認為可以在不同的環境條件下對煙草白粉病抗性基因進行進一步的QTL分析，以期獲得不同環境條件下的QTLs位點，對已得到的QTL位點進行驗證。

煙草白粉病是煙區廣泛分布的真菌性病害，對煙葉產量和品質造成嚴重影響，隨著分子標記技術的發展，為發掘、鑒定種質資源中QTL的等位變異提供了有效的技術手段，通過標記輔助選擇培育聚合不同QTL等位變異的高抗品種，將成為白粉病抗病基因資源鑒定與利用的一條新途徑[12]。

4 結論

本研究利用臺煙7號×NC89構建的F2群體對煙草白粉病抗性基因進行了QTL分析。檢測到1個與煙草白粉病抗性緊密連鎖的QTL位點，該QTL位于52725和54027之間，與52725的遺傳距離僅為1.01cm，其加性效應為-14.38，貢獻率為21.02%。

[1]朱朝賢, 王彥亭, 王智發, 等.中國煙草病害[M].北京:中國農業出版社, 2002: 75-77.

[2]李華麗, 陳美霞, 周東新, 等.煙草六個重要性狀的QTL定位[J].作物學報, 2011, 37(9): 1577-1584.

[3]Gregor Bindler, J?rg Plieske, Nicolas Bakaher.A high density genetic map of tobacco obtained from large scale microsatellite marker development[J].Theor Appl Genet,2011, 123: 219-230.

[4]劉仁虎, 孟金陵.MapDraw.在Excel中繪制遺傳連鎖圖的宏[J].遺傳, 2003, 25(3): 317-321.

[5]Zeng Z B.Theoretical basis of separation of multiple linked gene effects on mapping quantitative trait loci [J].Proc Natl Acad Sci USA, 1993, (90):10972-10976.

[6]佟道儒.煙草育種學[M].北京: 中國農業出版社, 1997:439-442.

[7]劉國順.煙草栽培學[M].北京: 中國農業出版社,2003:106-107.

[8]邢永忠, 徐才國, 華金平, 等.水稻穗部性狀的QTL與環境互作分析[J].遺傳學報, 2001, 28 (5): 439-446.

[9]白智龍, 袁曉君, 蔡潤, 等.黃瓜霜霉病抗性QTL分析[J].自然科學進展, 2008, 18(6): 706-710.

[10]Sakata Y, Kubo N, Morishita M, et al.QTL analysis of powdery mildew resistance in cucumber (Cucumis sativus L.) [J].Theor Appl Genet, 2006, 112: 243-250.

[11]劉龍洲, 蔡潤, 袁曉君, 等.黃瓜抗白粉病QTL分子標記定位[J].中國科學, 2008, 38(9): 851-856.

[12]霍納新, 周榮華, 張麗芳, 等.小麥白粉病抗性QTL分析[J].作物學報, 2005, 31(6): 692-696.