產廣譜細菌素乳酸菌的篩選及分類鑒定

滕志利 錢 方 姜淑娟 牟光慶

（大連工業大學食品學院，遼寧 大連 116034）

食品在加工與儲藏過程中，都不可避免會受到環境中微生物的污染，而引起腐敗變質，長期以來，食品工業都習慣于使用化學合成防腐劑，這些防腐劑對人體有一定的毒副作用［1］。乳酸菌素是由乳酸菌產生的一種具有活性的多肽或蛋白質，對人體完全無毒副作用，而且能夠被人體吸收，其應用前景越來越受到人們的關注［2］。中國對乳酸菌素的研究起步相對較晚，Nisin是目前研究最深入的乳酸菌素，但是Nisin的抑菌譜比較狹窄，所以其應用范圍受到了一定的限制［3］。本研究旨在篩選出產廣譜細菌素（既抑制革蘭氏陰性菌又抑制革蘭氏陽性菌）的乳酸菌菌株，并對其進行分類鑒定。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

1．1．1 采集樣品

泡菜、酸菜、酸奶、奶酪：市售。

1．1．2 指示菌

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌：本實驗室保存。

1．1．3 培養基

MRS培養基：蛋白胨1．0g、牛肉膏1．0g、酵母膏0．5g、K2HPO40．2g、檸檬酸二銨0．2g、乙酸鈉0．2g、葡萄糖2．0g、吐溫80 0．1mL、MgSO4·7H2O 0．058g、MnSO4·4H2O 0．025g、瓊脂1．5g，pH 6．8，蒸餾水100mL；

肉湯培養基：蛋白胨1．0g、牛肉膏0．3g、氯化鈉0．5g，pH 7．2，蒸餾水100mL；

分離培養基：蛋白胨1．0g、牛肉膏1．0g、酵母膏0．5g、K2HPO40．2g、檸檬酸二銨0．2g、乙酸鈉0．2g、葡萄糖2．0g、吐溫80 0．1 mL、MgSO4·7H2O 0．058g、MnSO4·4H2O 0．025g、碳酸鈣0．5g、1．6%的溴甲酚綠乙醇溶液0．14mL、瓊脂1．5g，pH 6．5，蒸餾水100mL；

營養瓊脂培養基：蛋白胨1．0g、牛肉膏0．3g、氯化鈉0．5g、瓊脂1．7g，pH 7．2，蒸餾水100mL［4］。

1．1．4 主要儀器與設備

恒溫磁力攪拌器：85－2型，鞏義市英峪予華儀器廠；

冷凍高速離心機：3－18K 型，德國Sigma公司；

精密pH 計：PHS－3C型，上海雷磁儀器廠；

手提式不銹鋼蒸汽消毒器：YX280A 型，上海三申醫療儀器有限公司。

1．2 方法

1．2．1 乳酸菌的分離 將泡菜汁（A）、酸菜汁（B）、酸奶（C）、奶酪汁液（D）各取1mL 左右加入到盛有9 mL 無菌生理鹽水試管中，連續10 倍遞增稀釋，取10－4，10－5，10－6稀釋液200μL，分別涂布于含有溴甲酚綠酒精溶液和碳酸鈣的MRS平板上，37℃培養48h。挑取鈣溶圈較大、培養基變黃的菌落，用平板劃線法在MRS平板上反復劃線分離，直至革蘭氏染色觀察中菌株顏色、大小、形態一致，選擇單菌落進行革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗。將革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性菌株劃線接種到MRS 斜面培養，4 ℃冰箱保存備用［5－7］。

1．2．2 產廣譜細菌素乳酸菌的初篩

（1）發酵上清液的制備：用接種環挑取活化的乳酸菌接種于MRS液體培養基中37 ℃培養48h，10 000r／min離心15min除去菌體，得到上清液。

（2）指示菌的培養和菌懸液的制備：將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌采用肉湯培養基，于37 ℃、160r／min搖床培養24h，通過傾注培養法測得兩種指示菌的菌液濃度，用無菌生理鹽水分別將它們稀釋成濃度為106個／mL 的菌懸液，4 ℃冰箱保存待用。

（3）抑菌試驗：采用牛津杯雙層瓊脂擴散法［8，9］。在已滅菌的平皿中倒入15mL 加熱融化的瓊脂（2%），完全凝固后，等距離放入滅菌牛津杯數個。將分裝于錐形瓶中的20mL營養瓊脂培養基融化后冷卻至55 ℃左右，加入濃度為106個／mL指示菌菌懸液300μL，迅速混合均勻，倒入平皿。冷卻后，移去牛津杯，作為乳酸菌素活性檢測平板。取150μL乳酸菌發酵上清液，以無菌操作加入到檢測平板圓孔內，同時做3組平行。37℃培養18h，量取抑菌圈直徑，選取小孔周圍有明顯抑菌圈的菌株待用。

1．2．3 產廣譜細菌素乳酸菌的復篩

（1）酸排除試驗：取pH 4．5作為無乳酸抑制作用的最小pH，用l mol／L NaOH 和1 mol／L HCl調節初篩菌株的發酵上清液pH 至4．5，以相應pH 值的MRS液體培養基為對照，然后進行抑菌試驗，同時做3組平行。37℃培養18h，量取抑菌圈直徑［10］。

（2）過氧化氫排除試驗：挑取排除酸作用后仍具有較強抑菌效果的菌株，將其發酵上清液于80 ℃加熱10 min后，進行抑菌試驗，同時做3組平行。37 ℃培養18h，量取抑菌圈直徑［10］。

（3）蛋白酶敏感性試驗：挑取排除酸、過氧化氫干擾后抑菌活性最強的菌株進行蛋白酶敏感性試驗，將此菌株的發酵上清液的pH 值調到胰蛋白酶、木瓜蛋白酶作用的最適pH 值7．0，按終濃度為1 mg／mL 加入各酶，37 ℃溫育2h，將pH 值調到4．5后進行抑菌試驗，同時做3組平行。37 ℃培養18h，量取抑菌圈直徑［10］。

1．2．4 產廣譜細菌素乳酸菌的分類鑒定 按照圖1的鑒定程序區分不同的乳酸菌菌屬，并通過個體形態和菌落特征、生理生化特性等對種進行鑒定。

圖1 乳酸菌屬鑒定程序［4，11］ Figure1 Identification procedure of Lactobacillus

2 結果與分析

2．1 乳酸菌的分離

從多種樣品中共篩選出30株乳酸菌，其中從泡菜中分離出17株、酸菜汁中7株、酸奶中4株、奶酪中2株。它們的菌落為乳白色或略顯黃色，光滑、濕潤，邊緣整齊，菌落凸起，革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗陰性，菌落周圍的鈣溶圈較大，且能使含有溴甲酚綠酒精的MRS培養基變成黃色，這些都符合乳酸菌的特征。

2．2 產廣譜細菌素乳酸菌的初篩

從30株乳酸菌中篩選出8株對兩種指示菌均有較強抑制作用的菌株，它們分別來源于泡菜（A）、酸菜汁（B），編號分別為A1、A5、A8、A9、A10、A13、B1、B5，抑菌結果見圖2。由圖2可知，所篩選出的8株乳酸菌的發酵產物對大腸桿菌的抑菌效果好于金黃色葡萄球菌。乳酸菌素的抑菌譜普遍較窄，一般僅對有親緣關系的種有抑制作用，所以此次篩選出的乳酸菌菌株具有廣譜抑菌作用，既抑制革蘭氏陽性菌，又抑制革蘭氏陰性菌。

2．3 產廣譜細菌素乳酸菌的復篩

2．3．1 酸排除試驗 乳酸菌發酵上清液對指示菌的抑制作用可能是乙酸、乳酸等某些有機酸作用，也可能是代謝合成的細菌素引起的，當pH 值為4．5時，可排除有機酸的干擾，調節試驗篩選菌株發酵上清液的pH 為4．5 后進行抑菌試驗。指示菌經過18h培養后觀察（見圖3），對照孔（pH 為4．5的MRS液體培養基）周圍沒有出現抑菌圈，而8株菌中仍有5株菌對指示菌有一定抑制作用，說明這5株菌的發酵上清液中除有機酸外還存在其它抑菌活性物質。

圖2 初篩乳酸菌抑菌活性Figure2 The inhibitory activity of preliminary screening lactic acid bacteia

圖3 各菌株發酵上清液的抑菌活性（pH 4．5）Figure3 The inhibitory activity of fermented supernatant for several bacterial strain

2．3．2 過氧化氫排除試驗 乳酸菌在代謝過程中產生的過氧化氫也可能抑制微生物的生長，故將上述5株菌的發酵上清液經80 ℃加熱處理10min，使過氧化氫充分分解，冷卻后進行抑菌試驗。抑菌結果表明（圖4），只有乳酸菌A5和A9的發酵上清液對兩種指示菌的抑菌活性變化較大，由此可知，乳酸菌A1、A8、B1的發酵上清液抑菌效果不是過氧化氫的作用，可能含有其它抑菌物質。

2．3．3 蛋白酶敏感性試驗 從乳酸菌A1、A8、B1中挑取抑菌作用最強的乳酸菌A8進行酶解試驗，按終濃度為1mg／mL將胰蛋白酶、木瓜蛋白酶加入到乳酸菌A8的發酵上清液中，然后進行抑菌試驗。由表1可知，乳酸菌A8的發酵上清液經胰蛋白酶、木瓜蛋白酶作用后，對兩種指示菌的抑菌活性完全喪失，表明此抑菌物質是一類細菌素。

圖4 各菌株發酵上清液的抑菌活性（80 ℃、10min）Figure4 The inhibitory activity of fermented supernatant for several bacterial strain

表1 乳酸菌A8 的發酵上清液蛋白酶敏感性試驗Table1 The susceptibility of fermented supernatant for Lactic acid bacteria A8to protease ／mm

2．4 產廣譜細菌素乳酸菌A8 的分類鑒定

2．4．1 個體形態和菌落特征 由圖5、6可知，篩選乳酸菌A8，其菌體細胞呈桿狀，單個、成對或成鏈狀排列，革蘭氏染色呈陽性，無芽孢；菌落表面光滑、邊緣整齊、乳白色不透明，這與乳桿菌較相似。

2．4．2 生理生化特性 乳酸菌A8的生理生化特性結果見表2。過氧化氫試驗、硝酸鹽還原試驗、吲哚試驗、明膠液化試驗均呈陰性，不產硫化氫，pH 4．5能生長，乳酸菌A8符合乳桿菌屬的生物學特性（圖1）。同時它能夠發酵果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、甘露醇、棉籽糖、山梨醇，不能發酵阿拉伯糖和木糖，參照文獻［4］可知，乳酸菌A8的糖

圖5 乳酸菌A8 的菌落特征Figure5 The colony of Lactic acid bacteria A8

圖6 乳酸菌A8 倍的菌體形態（10×100）Figure6 The thallus of Lactic acid bacteria A8

表2 乳酸菌A8 的生理生化特性Table2 Physiological and biochemical characteristics of Lactic acid bacteria A8

類發酵特性與植物乳桿菌（L．plantarum）、戊糖乳桿菌（L．pentosus）等菌株比較相似。

綜上，它與植物乳桿菌（L．plantarum）個體形態、菌落特征和生理生化特性基本相同，確定乳酸菌A8為植物乳桿菌，將其命名為Lactobacillus plantarum A8。

3 結論

本研究從多種樣品中篩選出30株乳酸菌，排除發酵上清液中有機酸、過氧化氫的影響后篩選得到1株分離自泡菜的具有較強抑菌活性的乳酸菌A8；通過蛋白酶敏感性試驗確定該菌株所產抑菌物質為具有蛋白質性質的細菌素，結合生理生化特性和形態學觀察，初步確定乳酸菌A8為植物乳桿菌（L．plantarum）。 目前，細菌素大多僅僅抑制同種的或親緣關系較近的細菌，而植物乳桿菌A8所產細菌素的抑菌譜較廣，并且對人體安全無毒，能夠被消化系統的蛋白酶分解成各種氨基酸而被人體吸收，所以它作為一種天然、高效、安全的新型防腐劑，有著廣闊的應用前景。

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10 張艾青，劉書亮，詹莉，等．產廣譜細菌素乳菌的篩選和鑒定［J］．微生物學通報，2007，34（4）：753～756．

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