白金針菇液體菌種優(yōu)良菌株選育

冀 宏 齊 斌 趙黎明

（1．天津大學(xué)管理與經(jīng)濟(jì)學(xué)部，天津 300072；2．常熟理工學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

金針菇（Flammulina velutipes）學(xué)名毛柄金錢菌，又稱毛柄小火菇、冬菇、構(gòu)菌、樸菌［1］。屬真菌門、擔(dān)子菌綱、傘菌目、金針菇屬。金針菇因其菌柄細(xì)長(zhǎng)，似金針菜，故稱金針菇，以其菌蓋滑嫩、柄脆、營(yíng)養(yǎng)豐富、味美適口而深受大眾喜愛，常用作涼拌菜和火鍋的上好食材。除具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外還兼具藥用食療價(jià)值，研究［2－6］發(fā)現(xiàn)金針菇多糖有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性。

按子實(shí)體的色澤可將金針菇分為黃色品系、淺黃色品系和白色品系。白色品系菌蓋、菌柄純白色，絨毛少或無［7］，白色品系是金針菇工廠化生產(chǎn)主要品種［8，9］。目前，中國(guó)白金針菇工廠化生產(chǎn)普遍使用固體菌種技術(shù)，存在制種周期長(zhǎng)、隱性污染幾率大、菌齡不齊難以標(biāo)準(zhǔn)化管理等弊端。興起21世紀(jì)初的液體菌種技術(shù)可為改變現(xiàn)狀、實(shí)現(xiàn)突破提供可行的技術(shù)方案。與固體菌種相比，液體菌種具有生產(chǎn)周期短、菌種純度高、接種后萌發(fā)生長(zhǎng)迅速、菌絲體活力旺盛、使用成本低等明顯優(yōu)勢(shì)，尤其適合大規(guī)模工廠化應(yīng)用，性狀優(yōu)良的液體菌種要求發(fā)酵生物量高、菌絲球直徑較小、密度較大、生長(zhǎng)活力旺盛［10，11］。同工酶分析作為分子遺傳標(biāo)記技術(shù)之一，不僅被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的遺傳分析、生理生化研究，而且被作為化學(xué)分類的重要指標(biāo)應(yīng)用于真菌的分類鑒定中，是菌株分類鑒定和親緣關(guān)系研究的重要手段，廣泛應(yīng)用于食用菌菌種鑒定及遺傳學(xué)研究［12，13］，關(guān)于同工酶在大型真菌分類鑒定中成功應(yīng)用已有報(bào)道［14－16］。

本試驗(yàn)收集了6株中國(guó)白金針菇產(chǎn)區(qū)的主要生產(chǎn)菌種，通過觀測(cè)和比較發(fā)酵菌絲體生物量、菌絲球直徑、密度及其生長(zhǎng)活力等指標(biāo)，綜合確定適合制備液體菌種的白金針菇優(yōu)良菌株，旨在為工廠化生產(chǎn)白金針菇的液體菌種制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

1．1．1 供試菌株

試驗(yàn)用斜面菌種（表1）：由常熟理工學(xué)院食用菌工程技術(shù)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)接并保藏。

表1 金針菇菌株編號(hào)Table1 The number of Flammulina velutipes strains

1．1．2 主要試劑

維生素B1、過硫酸銨、蔗糖、Tris、TEMED、Acr、Bis、甘氨酸、乙酸－1－萘酯、乙酸－2－萘酯、固蘭RR 鹽、丙酮、溴酚藍(lán)、石英砂等：分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司；

黃豆粉、玉米粉、馬鈴薯等：市購(gòu)。

酯酶同工酶電泳的試劑：本實(shí)驗(yàn)室參照文獻(xiàn)［13］自制。

1．1．3 培養(yǎng)基配方

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯20g，葡萄糖2g，瓊脂2g，自來水100mL，pH 自然；

液體培養(yǎng)基：葡萄糖2g／100mL，玉米粉2．5g，黃豆粉1g，磷酸二氫鉀0．1g，硫酸鎂0．5g，維生素B15mg，自來水100mL，pH 自然。

1．2 儀器與設(shè)備

電子天平：M124A 型，伯拉莫貝林（上海）精密儀器有限公司；

便攜式（數(shù)顯）pH 計(jì)：FE20型，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；

超凈工作臺(tái)：CJ－2S型，天津泰斯特儀器有限公司；

振蕩培養(yǎng)箱：ZQWY－200G 型，上海知楚儀器有限公司；

人工氣候箱：PQX－280A－22HM 型，寧波萊福科技有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：Centrifuge 5418R 型，德國(guó)Eppendorf公司；

移液槍：100－1000型，Eppengorf中國(guó)有限公司；

垂直板電泳槽：DYCZ－24DN 型，北京六一儀器公司；

電泳儀：DYY－6C型，北京六一儀器。

1．3 方法

1．3．1 金針菇的液體培養(yǎng) 按1．1．3配方配制培養(yǎng)基，滅菌結(jié)束后先冷卻再接種，以免培養(yǎng)基過燙殺死菌種；活化后的金針菇菌種從冰箱中拿出后要先置于25 ℃下復(fù)活2h左右，再無菌接種0．5cm×0．5cm 的菌種塊（10d菌齡）于搖瓶?jī)?nèi)，注意盡量使菌塊漂浮在液面上，每瓶接種2塊；25℃下靜置培養(yǎng)24h后，置于25 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12d［14］，搖床轉(zhuǎn)速180r／min。

1．3．2 金針菇液體菌種優(yōu)良菌株的篩選

（1）菌絲球直徑的測(cè)定：隨機(jī)取菌球20個(gè)，將其排成一條直線，測(cè)其總長(zhǎng)度，重復(fù)3次，取平均值［15］記為D，菌絲球直徑即d ＝D／20。

（2）菌絲球數(shù)量的測(cè)定：取10 mL 的發(fā)酵液，80目標(biāo)準(zhǔn)篩過濾，然后計(jì)數(shù)，此數(shù)值記為n 個(gè)。100mL 發(fā)酵液中菌絲球數(shù)目為N ＝10×n。

（3）菌絲體干重的測(cè)定：取10 mL 發(fā)酵醪液于80目標(biāo)準(zhǔn)篩過濾，用蒸餾水反復(fù)沖洗3次，將過濾所得的菌絲體于60 ℃數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，用分析天平稱重，得到金針菇菌絲體細(xì)胞干重（md）［17］記為w，100 mL 發(fā)酵液中菌絲體的干重為W ＝10×w。

（4）活力值的測(cè)定：回接過程在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，從培養(yǎng)12d的搖瓶中取直徑差不多大的菌絲球接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，菌種盡量接種到平皿中央，每個(gè)菌種做3個(gè)平行，并重復(fù)3次。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌絲在培養(yǎng)基表面開始生長(zhǎng)，從第4天至第7天每隔24h用十字交叉法測(cè)定一次菌落直徑，計(jì)算菌絲體日均生長(zhǎng)速度，同時(shí)觀察記載菌絲長(zhǎng)勢(shì)，即菌絲濃密程度及色澤等［17］。

菌絲體日均生長(zhǎng)速度按式（1）計(jì)算：

1．3．3 拮抗試驗(yàn) 取直徑90mm 的平皿，無菌條件下倒入PDA 培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，在同一PDA 平板上接種2個(gè)不同的菌種（兩點(diǎn)拮抗），兩兩接種塊之間間距1．5～2．0cm，25 ℃下恒溫培養(yǎng)，每天進(jìn)行觀察，有染菌的平皿要及時(shí)清理以免污染未染菌的平皿，并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1．3．4 酯酶同工酶譜分析 酯酶同工酶電泳方法參照文獻(xiàn)［18－21］。

觀察樣品酶帶的位置，按式（2）計(jì)算每條酶帶的Rf值：

式中：

Rfn—— 條帶n 的遷移率；

dn—— 條帶n 的遷移距離，cm；

d—— 溴酚蘭的遷移距離，cm。

相似性判斷公式（3）：

式中：

Se—— 被檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品二者間相似系數(shù)；

Sxy—— 被檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品二者間共有酶帶數(shù)；

Sx—— 標(biāo)準(zhǔn)樣品特有酶帶數(shù)；

Sy—— 被檢樣品特有酶帶數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2．1 金針菇品種之間的拮抗試驗(yàn)

拮抗試驗(yàn)是用來檢測(cè)地域差異較大菌株的方法之一，兩菌種之間的拮抗線越明顯，說明這兩個(gè)菌種之間的地域差異越大，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。通過兩點(diǎn)拮抗試驗(yàn)觀察（圖1）得到的試驗(yàn)結(jié)果見表2。

圖1 拮抗試驗(yàn)部分照片F(xiàn)igure1 The picture of antagonistic experiments

表2 金針菇品種間的拮抗試驗(yàn)Table2 Antagonistic experiments Result of Flammulina velutipes

由圖1和表2可知，除品種2和品種3、品種1和品種4、品種6和品種4外，其余平皿中間均有明顯的拮抗線，說明其余品種之間的地域差異較大；而品種2和品種3、品種1和品種4、品種6和品種4之間的拮抗線不明顯，但拮抗線依然存在，說明這兩個(gè)品種之間的地域差異較小，親緣關(guān)系較近。

2．2 不同品種金針菇的酯酶同工酶譜的分析

酯酶同工酶電泳圖譜中譜酶帶的位置是由編碼各酶帶的基因直接決定的，所以從酶帶的位置可知道此6個(gè)品種金針菇的基因型是否有差異；同時(shí)，酶帶寬度和顏色深淺可表明酶的活性和含量［14］，同樣可作為判斷遺傳差異的依據(jù)。圖2是6個(gè)品種金針菇的酯酶同工酶譜鑒定結(jié)果，圖3中數(shù)據(jù)代表Rf值。

圖2 6個(gè)品種金針菇的酯酶同工酶圖譜Figure2 The result of esterase isoenzyme electrophoresis in 6varieties

圖3 6個(gè)品種金針菇的酯酶同工酶模式圖Figure3 The schema chart of esterase isoenzyme electrophoresis in 6varieties

各品種金針菇酶帶的遷移率見表3。由表3可知，有些菌株間酶譜差異較小，酶帶數(shù)相同，酶譜相似，而有些菌株間酶譜差異較大。其中有4條是6個(gè)品種均有的酶帶，可認(rèn)為這4條酶帶是金針菇的基礎(chǔ)酶帶，個(gè)別菌株有其特征酶帶［21］。

表3 6個(gè)品種金針菇的酯酶同工酶條帶的遷移率Table3 The mobility comparison of esterase isoenzyme band in 6varietise

根據(jù)式（2）和（3）可計(jì)算出各品種之間的相似系數(shù)Se，相似系數(shù)表明了兩者之間的親緣關(guān)系。由表4可知，品種2和品種3、品種4和品種6之間的相似系數(shù)分別為0．923和0．933，從酶譜上（圖2和3）也可看出兩品種之間在酶帶數(shù)量和表達(dá)位置上只有1條譜帶之差，這說明了兩者遺傳基礎(chǔ)非常相似。其余品種之間的相似系數(shù)在0．667～0．857，表明兩品種之間的遺傳基礎(chǔ)有差異［22］。

表4 6個(gè)品種金針菇的酯酶同工酶的相似系數(shù)Table4 The similarity coefficient of esterase isoenzyme in 6varietise

酯酶同工酶譜分析得出的結(jié)論與拮抗試驗(yàn)的結(jié)果基本吻合，說明6個(gè)品種之間存在或遠(yuǎn)或近的親緣關(guān)系。

2．3 不同品種金針菇液體發(fā)酵的性狀

為篩選出適合液體發(fā)酵的品種，將發(fā)酵培養(yǎng)出的金針菇菌絲球的直徑、密度和干重作為篩選依據(jù)，不同品種金針菇液體發(fā)酵的性狀見表5。

表5 金針菇液體發(fā)酵菌株的性狀Table5 The screening basis of predominant strain of Flammulina velutipesin liquid culture（n ＝10）

由表5可知，各品種干重由大到小為品種6＞品種3＞品種2＞品種5＞品種1＞品種4。其中品種3和品種6的干重最大，分別為1．628g／100 mL 和1．662g／100 mL。液體發(fā)酵中干重∶濕重≈1∶9，干重約達(dá)到1．6g／100 mL，說明100mL培養(yǎng)基能培養(yǎng)出至少14．4g（鮮重）菌絲球。可初步判斷品種3和品種6較適合進(jìn)行液體發(fā)酵。

對(duì)于液體發(fā)酵的菌絲球直徑一般要求在0．2cm 左右，6個(gè)品種菌絲體直徑由大至小依次為品種5＞品種6＞品種2＞品種1＞品種4＞品種3，除品種5外，其余5個(gè)品種的直徑都在0．2cm 左右，差別不大。重點(diǎn)研究品種3和6可發(fā)現(xiàn)，品種3的直徑是最接近要求。

對(duì)于液體發(fā)酵的菌絲球密度要求在3 000個(gè)／100mL左右，達(dá)到此要求的只有品種3，菌絲球密度由大至小依次為品種3＞品種4＞品種1＞品種6＞品種5＞品種2。品種2和5菌絲球密度分別為2 079，2 216個(gè)／100mL，除與所要求的3 000 個(gè)／100 mL 差 別 較 大 外，與 其 余4 個(gè) 品 種 的 差 別 也較大。

綜上所述，品種3的菌絲體直徑最小僅為0．203cm，且密度最大可達(dá)到3 045個(gè)／100mL、干重1．628g／100mL，是本試驗(yàn)篩選出的優(yōu)勢(shì)菌株；而品種6 的菌絲體直徑0．233cm、密度2 631個(gè)／100 mL、干重1．662g／100 mL，是本試驗(yàn)篩選出的較優(yōu)菌株。

2．4 不同品種金針菇菌株活力值

將發(fā)酵好的液體菌絲球回接到固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，以測(cè)定菌株活力值。本試驗(yàn)測(cè)定了6個(gè)品種金針菇接種至平板后第4～7天的菌落半徑，并計(jì)算出日均生長(zhǎng)速度，結(jié)果見表6。

表6 不同品種金針菇菌株菌絲體的生長(zhǎng)情況Table6 The result of mycelial growth in six Flammulina velutipes（n ＝3）

由表6可知，6個(gè)品種生長(zhǎng)速度由快到慢依次為品種2＞品種1＞品種6＞品種4＞品種5＞品種3。除了生長(zhǎng)最快的品種2（生長(zhǎng)速度0．535cm／d）和生長(zhǎng)最慢的品種3（生長(zhǎng)速度0．349cm／d）外，其余4個(gè)品種的平均生長(zhǎng)速度差別不大。結(jié)合2．3得出的結(jié)論，可篩選出白金針菇液體發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)菌株為品種6，即河北金針菇。

3 結(jié)論

（1）本試驗(yàn)篩選出了既適合液體發(fā)酵培養(yǎng)又能夠工廠化栽培高產(chǎn)的白金針菇優(yōu)良菌株。通過液體發(fā)酵技術(shù)篩選出優(yōu)勢(shì)菌株為日本白金金針菇和河北金針菇；再通過液體發(fā)酵菌絲球回接生長(zhǎng)速度比較試驗(yàn)確定河北金針菇為液體菌種優(yōu)良菌株。

（2）酯酶同工酶電泳的鑒別方法和拮抗試驗(yàn)都是鑒定菌種親緣關(guān)系的方法，但酯酶同工酶電泳準(zhǔn)確度更高，表現(xiàn)出的信息也更多，后續(xù)試驗(yàn)還可運(yùn)用分子生物學(xué)手段進(jìn)一步分析確定6個(gè)品種金針菇之間的遺傳關(guān)系。

（3）通過菌絲體回接試驗(yàn)確定菌株活力值的方法還不夠完善，尚需進(jìn)行工廠化出菇試驗(yàn)才能準(zhǔn)確測(cè)定液體菌種的生產(chǎn)性能。

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