羅田金銀花葉中綠原酸的提取工藝改進

向 福 劉 亮 秦 婷 曹 禺 方元平 項 俊

（1．經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室，湖北 黃州 438000；

2．黃岡師范學院，湖北 黃州 438000）

金銀花為忍冬科植物的花蕾及初開的花，具有廣譜抗菌、抗病毒、抗腫瘤，及解熱抗炎、利膽保肝、降脂、止血、抗潰瘍等藥理作用［1］，可廣泛用于醫藥、食品和保健等領域。綠原酸是金銀花的主要活性成分，高純度綠原酸價格昂貴，被稱為“植物黃金”［2］。湖北羅田縣特產羅田金銀花為盤葉忍冬（Lonicera tragophylla Hemsl），香氣濃郁，綠原酸等有效成分高，2011年獲中國地理標志產品保護。

長期以來，金銀花葉一直被視為非藥用部位而未能得到合理開發和利用，造成了資源極大的浪費。事實上，十多年前人們就發現山東、河南等地金銀花葉中的綠原酸含量幾乎超過了同一時期的金銀花［2，3］。后來還發現金銀花葉和金銀花在臨床上均有清熱解毒之功效，金銀花的莖葉，尤其是葉的有效成分的藥理作用不亞于金銀花［4］。筆者［5］前期發現羅田金銀花葉中的綠原酸含量高達7%左右，超過同一時期花中含量的一倍多。另一方面，金銀花葉藥源遠比金銀花豐富。有研究［6］表明，金銀花葉的產量大約是同期花產量的10倍，且采集容易，價格便宜。當前金銀花價格逐年看漲，采用金銀花葉提取綠原酸，不僅能降低生產原料成本，還能科學合理利用金銀花資源。因此，研究羅田金銀花葉中綠原酸的提取工藝，可為地方金銀花資源高附加值產品的精深加工提供科學依據和技術支撐，對促進大別山地區金銀花產業的發展具有重要的應用價值和現實意義。

綠原酸提取的傳統工藝為醇提法和水提法：醇提法雖然綠原酸的產率高、提取雜質少，但有機溶劑消耗量大；水提法雖無需消耗有機溶劑，但多糖等水溶性雜質多、綠原酸的產率低［7］。Zhao等［8］研究表明，多孔介質孔內液體沸騰時會產生對流。植物內為多孔結構，孔內溶液沸騰所產生的對流則帶動孔內的質量傳遞。韋藤幼等［9］研究發現，乙醇溶液浸入植物內部溶解的有效成分濃度較高，孔內沸騰時隨對流從植物內部快速擴散到植物外部，提取速度發生突變，提取過程得到強化。考慮到綠原酸一方面對熱敏感，穩定性較差，不宜進行長時間高溫提取；另一方面又易溶于乙醇，且不同濃度的乙醇溶液透過細胞壁和解吸綠原酸的能力不同，本試驗在傳統工藝基礎上提出一種改進工藝，即先用少量乙醇溶液浸析金銀花葉，將綠原酸從細胞組織中溶解，然后加入沸水使金銀花葉孔內的乙醇溶液迅速沸騰而強化提取效果，從而大大縮短提取時間和減少乙醇溶液消耗，節約生產成本。

1 材料與方法

1．1 材料、試劑與儀器

羅田金銀花葉：湖北楚天舒藥業有限公司，陰干，粉碎備用（80目）；

綠原酸標準品：批號20120117，上海源葉生物科技有限公司；

無水乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉：分析純，天津市凱通化學試劑有限公司；

紫外 可 見 分 光 光 度 計：Varian Cary 100Scan 型，美 國Varian公司；

電子 天 平：Ax－205 METTLER TOLEDO 型，瑞 士 梅 特勒－托利多集團；

旋轉蒸發器：RE－S2AA 型，上海亞榮生化儀器廠。

1．2 試驗方法

1．2．1 水提法 將金銀花葉粉碎，稱取10．00g粉末并加入蒸餾水，固液比為1∶20（m∶V），80 ℃回流45 min，共提3次，冷卻至室溫過濾，合并濾液，用旋轉蒸發器在70 ℃條件下濃縮至50mL左右，得綠原酸提取液。

1．2．2 醇提法 將金銀花葉粉碎，稱取10．00g粉末并加入120mL 70%乙醇溶液，于80 ℃下回流60min，冷卻至室溫，過濾，重復3次，濾液合并，用旋轉蒸發器在70 ℃條件下濃縮至50mL左右，得綠原酸提取液。

1．2．3 改進工藝 將金銀花葉粉碎，稱取10．00g粉末并加入一定體積及濃度的乙醇溶液，常溫下浸析過夜，再加入一定體積和pH 的沸騰蒸餾水，在沸水水浴中攪拌提取一定時間，提取3次，冷卻至室溫過濾，合并濾液，用旋轉蒸發器在70 ℃條件下濃縮至50mL左右，得綠原酸提取液。

為探討改進工藝的最佳操作條件，針對關鍵因子設計了單因素試驗，各因素水平梯度：乙醇體積分數為55%，60%，65%，75%，80%；乙醇浸析料液比1∶3，1∶3．5，1∶4，1∶4．5，1∶5（m ∶V）；沸水料液比1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25（m∶V）；pH 值2，3，4，5，6；水浴攪拌時間10，20，30min。

1．3 綠原酸含量測定

1．3．1 最大波峰掃描 精密稱定綠原酸標準品5 mg，用蒸餾水混勻定容到10mL 即為標準品溶液。用紫外可見分光光度計掃描綠原酸標準品溶液，確定檢測波長為323nm。

1．3．2 標準曲線測定 精密吸取綠原酸標準品溶液5，10，15，20，25，30，35，40，45，50μg／mL，測定吸光度，回歸處理結果表明，綠原酸在5 ～50μg／mL 濃度范圍與吸光度呈良好線性關 系，回 歸 方 程 為Y ＝0．043 5 X ＋0．021 7，R2＝0．999 4。

1．3．3 綠原酸含量測定 用紫外可見分光光度計于323nm 處測定綠原酸提取液的吸光度，根據標準液擬合的回歸方程計算綠原酸含量。

2 結果與討論

2．1 乙醇濃度的影響

圖1是羅田金銀花葉粉末在35 mL 乙醇溶液浸析過夜后，用200mL pH 為4的沸水水浴攪拌提取10min條件下，不同乙醇濃度提取綠原酸的結果。

圖1 乙醇濃度對綠原酸提取濃度的影響Figure1 Effects of alcohol concentration on extraction

由圖1可知，在乙醇濃度60%時出現一個峰值，綠原酸提取濃度達到最佳。隨著乙醇濃度的增加，綠原酸的提取濃度持續下降，在80%乙醇濃度時略有回升。乙醇溶液浸析金銀花葉的過程相當于綠原酸在細胞中的解析過程，不同濃度的乙醇溶液解析細胞內活性物質的能力不同。圖1結果表明60%乙醇溶液解析效果最好，提取的綠原酸濃度高。

2．2 乙醇用量的影響

金銀花葉粉末在60%乙醇浸析過夜后，用200 mL pH為4的沸水水浴攪拌提取10 min條件下，不同乙醇用量對綠原酸提取效果的影響見圖2。

圖2 乙醇用量對綠原酸提取濃度的影響Figure2 Effects of alcohol volume on extraction

由圖2可知，隨著乙醇浸析料液比的增加，提取的綠原酸濃度迅速達到最大值。當乙醇的浸析物料比較低時，乙醇用量少，細胞中的綠原酸不能充分解析，所提取綠原酸的濃度低，吸光度值小。但當乙醇的物料比達到1∶3．5（m∶V）后（即35mL），綠原酸已充分解吸，再增加乙醇的浸析物料比，綠原酸的濃度無明顯變化。因此，試驗中確定乙醇溶液最適用量為35mL。

2．3 沸水用量的影響

金銀花葉在35mL 60%乙醇溶液浸析后，在pH 4條件下用不同物料比的沸水水浴攪拌提取10min，結果見圖3。

圖3 沸水用量對綠原酸提取濃度的影響Figure3 Effects of boiling water volume on extraction

由圖3可知，當沸水用量達到200 mL 時綠原酸的濃度已經增加緩慢，即料液比為1∶20（m∶V）的沸水用量即可獲得較好的提取效果。沸水用量少，不足以充分提取綠原酸，但沸水用量太大反而會增加多糖等水溶性雜質的溶出。

2．4 pH 的影響

金銀花葉在35mL 60%乙醇溶液浸析后，在不同pH 條件下用200mL沸水水浴攪拌提取10min，結果見圖4。

圖4 pH 對綠原酸提取濃度的影響Figure4 Effects of pH on extraction

由圖4可知，綠原酸的濃度在pH 4達到峰值，隨著pH值的增加，綠原酸濃度變化趨于平緩。該結果表明，酸性有利于綠原酸的提取，pH 為4時羅田金銀花葉中的綠原酸提取效果較好。

2．5 水浴攪拌時間的影響

金銀花葉在35 mL 60%乙醇溶液浸析后，用200 mL pH 為4的沸水水浴攪拌提取不同時間，結果見圖5。由圖5可知，水浴攪拌時間為10min時的提取效果最好，隨著時間的增加，綠原酸的濃度有所下降。金銀花葉中綠原酸的提取過程實質是固相傳遞至液相的傳質過程，也就是綠原酸從高濃度區向低濃度區的滲透過程。攪拌提取初期金銀花葉與溶劑中的綠原酸在單位時間內具有較高的濃度差，浸出較快，但金銀花葉處于長時間高溫浸提，會導致表面產生過熟化和結膜以及物料內膠質等過度糊化［10］，阻礙綠原酸浸出。

圖5 水浴攪拌時間對綠原酸提取濃度的影響Figure5 Effects of stirring time on extraction

綠原酸為熱敏性物質，熱穩定性較差，較高溫度下進行長時間提取易分解，這是導致高溫提取10 min后綠原酸濃度下降的主要原因之一。另外，隨著提取時間的延長，提取物中的多糖等雜質會大量增加，必然導致提取物中綠原酸含量的降低。因此，沸水浴中攪拌提取綠原酸的最佳時間為10min。

2．6 改進工藝的優勢

根據以上單因素分析，確定改進工藝的最佳操作參數為浸析乙醇濃度60%，浸析物料比1∶3．5（m∶V），沸水物料比1∶20（m∶V），pH 為4，沸水水浴攪拌10min，該條件下提取羅田金銀花葉中綠原酸較傳統水提法和醇提法在提取時間和乙醇用量兩方面都有明顯優勢（見表1）。改進工藝中由于金銀花葉經過乙醇溶液浸析，將綠原酸從細胞組織中溶解，在沸水作用下乙醇溶液在金銀花葉微孔內沸騰，強化了綠原酸的提取速度，提取時間比傳統水提法減少3．5倍，只有醇提法的1／6。就乙醇用量而言，傳統水提過程無乙醇消耗，醇提法乙醇消耗量大，而改進工藝的乙醇消耗量相對較小，約為醇提法的8．3%左右（按無水乙醇計）。

表1 不同提取方法比較Table1 Results from different extraction methods

針對金銀花葉中綠原酸的產業化分離，筆者課題組利用D101大孔樹脂建立了經濟可行的生產工藝［11］。

3 結論

（1）與傳統提取法相比，用乙醇溶液浸析、內部沸騰的改進工藝能強化羅田金銀花葉中綠原酸的提取過程，具有提取時間短、乙醇用量少等特點，簡單易行，有利于工業化生產。最佳工藝參數為乙醇濃度60%，浸析乙醇物料比1∶3．5（m∶V），pH 4，沸水物料比1∶20（m∶V），水浴攪拌10min。

（2）本試驗將羅田金銀花葉進行利用，增加了金銀花資源的精深加工力度，擴展了金銀花資源的綜合利用范圍，可促進大別山地區或其他金銀花產地金銀花產業的發展。

（3）用響應面分析優化最佳提取工藝以及乙醇溶液在金銀花葉中內部沸騰的機理有待進一步研究。

1 王晶亭，靳超，許超．簡述金銀花的最新藥理研究［J］．中國中醫藥資訊，2012，4（3）：2～3．

2 林慧彬，彭廣芳，鐘方曉，等．山東金銀花葉的質量研究［J］．時珍國醫國藥，1997，8（2）：125．

3 潘秋文．金銀花葉的研究進展［J］．浙江中醫學院學報，2004，28（4）：90．

4 李玉賢，楊懷霞，武雪芬．金銀花莖葉藥用價值概述［J］．河南中醫藥學刊，2000，15（3）：23～24．

5 向福，郭文韜，袁婷，等．羅田縣兩種金銀花中綠原酸含量的比較［J］．黃岡師范學院學報，2013，33（3）：36～37，43．

6 熊建華，湯凱潔，羅秋水，等．大孔吸附樹脂純化金銀花葉總多酚的工藝優化［J］．食品與機械，2011，27（3）：52～55，67．

7 趙鐘興，韋藤幼，郝瑞然，等．從金銀花中提取綠原酸生產工藝的改進［J］．時珍國醫國藥，2004，15（12）：829～830．

8 Zhao T S，Liao Q．On capillary－driven flow and phase－change heat transfer in a porous structure heated by a finned surface：measurements and modeling［J］．International Journal of Heat and Mass Transfer，2000，43（7）：1 141～1 155．

9 韋藤幼，趙鐘興，郝瑞然，等．內部沸騰強化肉桂皮中肉桂醛的提取工藝及機理［J］．林產化學與工業，2006，26（3）：63～65．

10 林啟訓，蔡姍姍，雷潤波．金銀花沖泡浸提的影響因素分析及狀態參數優化［J］．食品與機械，2002（6）：7～9．

11 向福，馮鵬，劉亮，等．大孔樹脂對羅田金銀花葉中綠原酸的分離研究［J］．食品與機械，2013，29（4）：141～144．