硫酸酯化川芎粗多糖的半合成及其抗氧化活性*

郭曉強，顏 軍，何 鋼，孫曉春，姚 倩，茍小軍

(1.成都大學a.生物產業(yè)學院;b.藥食同源植物資源開發(fā)四川省高校重點實驗室，四川成都 610106)

中藥川芎為傘形科植物川芎的干燥根莖，始載于《神農本草經》。川芎味辛、性溫，具有活血止痛、行氣開郁、祛風燥濕之功效。早期從國產川芎分離出易揮發(fā)的油狀生物堿、阿魏酸、酚性物質和揮發(fā)油等［1］;范志超等［2］報道川芎粗多糖分離的四種均一多糖組分;本課題組［3］也采用DEAE-纖維素柱層析分離得到3個川芎多糖組分。但到目前為止，僅有原江鋒等［4］對川芎粗多糖抗氧化活性進行了研究。

多糖中取代基的改造己成為研究多糖構效關系的有力手段，可以通過降解、羧甲基化、硫酸酯化、乙酰化、烷基化、磷酸酯化等改造多糖取代基的方法有目的地得到高生物活性的多糖或寡糖片段。目前，國內外還未見關于川芎多糖化學修飾的報道。

本文以水提醇沉法提取川芎粗多糖［主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等吡喃型糖組成［2，3］，用 D-OH(1)表示］。首次報道了 1與氯磺酸-吡啶經親核取代反應半合成硫酸酯化川芎粗多糖(2，Scheme 1)的方法，其結構經UV和IR表征。對制備工藝進行了優(yōu)化。用氯化鋇-明膠比濁法測定2的取代度，并考察了1和2對鄰苯三酚自氧化反應產生的超氧陰離子(O-·2)和1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)的體外清除自由基能力。比較了化學修飾前后川芎粗多糖體外抗氧化活性的變化，以此來研究硫酸酯基團的引入對川芎粗多糖抗氧化活性的影響，為川芎多糖構效關系研究提供基礎。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UV-2802PC型紫外掃描儀;UV-1800型紫外分光光度計;Spectrum Two型紅外光譜儀(KBr壓片)。

川芎，成都市中藥材市場，經成都大學生物產業(yè)學院陳封政教授鑒定;1按文獻［3］方法提取，Sevage試劑除蛋白，提取率5.7%;DPPH，百靈威科技公司;其余所用試劑均為化學或分析純。

1.2 合成［5，6］

在三頸燒瓶中加入吡啶20 mL，冰鹽浴冷卻，攪拌下于緩慢滴加氯磺酸5 mL{y［V(吡啶)∶V(氯磺酸)=3}(控制滴加速度使溫度保持在室溫以下)，滴畢，反應至終點得淡黃色固體磺酰化試劑(Ⅰ)。加入1 0.25 g的DMF(25 mL)懸浮液，于60℃反應3 h。冷至室溫，用5 mol·L-1氫氧化鈉溶液調至pH 7。加入乙醇至終濃度80%，析出沉淀，離心，沉淀用水溶解，置自來水中透析48 h;蒸餾水中透析24 h。真空冷凍干燥得白色固體210.22 g，收率88%;UV:λmax:215，260 nm;IR ν:3 431(O -H)，2 927(C -H)，1 737，1 637(C=O)，1 407(C -H)，1257(S=O)，1 025(C-O-C)，814(C-O-S)cm-1。

改變y，反應溫度和反應時間，用類似方法合成2n(表1)。

表1 2的制備條件Table 1 Preparation condition of 2

1.3 取代度的測定

以硫酸鉀為標準品，按文獻［7～9］方法繪制氯化鋇-明膠標準曲線。

將樣品40 mg溶于1 mol·L-1鹽酸(2 mL)中，封管，置100℃沸水浴中1 h。取0.2 mL進行分析。根據測定的樣品吸光度從標準曲線中得到試樣中的百分含量，計算取代度(DS)［DS=1.62×S%/(32-1.02×S%)，S%為樣品中硫元素的百分含量］。

1.4 清除率測定

在樣品溶液(c=3.0 mg·mL-1)0.1 mL 中加入 50 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.2)緩沖溶液(5 mL)中，于 25℃水浴中攪拌 10 min;加入 6 mmol·L-1鄰苯三酚 0.2 mL，搖勻;每隔 30 s 取樣，于4 min內在325 nm處測定吸光值(A)。以0.1 mL蒸餾水代替樣品溶液，0.2 mL蒸餾水代替鄰苯三酚作參比液，0.1 mL蒸餾水代替樣品溶液作空白溶液;Vc作陽性對照，繪制A對時間的曲線，曲線斜率即為自氧化速率(K)，對的清除率按下式計算:

(2)清除DPPH自由基清除率測定［10］

在樣品溶液(c=3.0 mg·mL-1)1 mL 中加入0.6 mmol·L-1DPPH 溶液 2 mL和 95%乙醇 2 mL，攪拌均勻后 避光反應30 min，于517 nm處測定吸光值(A1)。另取1 mL蒸餾水代替樣品溶液作對照，測定吸光度值(A0);1 mL蒸餾水代替樣品溶液，2 mL 95%乙醇代替DPPH溶液作參比，測定吸光度值(A2)(以Vc為陽性對照)，按下式計算清除率(DPPH)。

2 結果與討論

2.1 制備2的條件優(yōu)化

(1)y［V(吡啶)∶V(氯磺酸)］

以DS為考察標準，對合成2的反應條件進行優(yōu)化。

于60℃反應3 h，其余反應條件同1.2，考察y對反應的影響，結果見表2。由表2可知，2的DS的大小并非嚴格遵循y提高而增加。當y=4，DS達最大值(0.958 9)。在硫酸酯化反應過程中吡啶作為縛酸劑中和反應副產物氯化氫，以促進反應平衡向酯化產物的生成方向。另外吡啶還起到催化反應的作用，吡啶首先與酯化試劑生成活性中間體，再與多糖分子上的醇羥基生成酯［11］。在實驗條件下，最佳y=4。

表2 y對反應的影響*Table 2 Effect of y on reaction

(2)反應時間

y=4，其余反應條件同1.2，考察時間對反應的影響，結果見表3。由表3可見，反應3 h時，DS達最大值(0.958 9)。隨著反應時間的進一步延長，DS反而有所下降。這可能是2在酸性條件下降解所致。最佳反應時間為3 h。

表3 反應時間對反應的影響*Table 3 Effect of time on reaction

(3)反應溫度

y=4，反應時間 3 h，其余反應條件同 1.2，考察溫度對反應的影響，結果見表4。從表4可見，于50℃ ～70℃間反應，產物的DS逐漸增大。當溫度為70℃時，DS達最大值(1.761 6)。可能是在一定的溫度范圍內提高反應溫度有利于加快反應速率，但反應溫度過高時，可能會導致多糖的降解。最佳反應溫度為70℃。

表4 反應溫度對反應的影響*Table 4 Effect of temperature on reaction

綜上所述，制備2的最佳反應條件為:V(吡啶)∶V(氯磺酸)=4，于70℃反應3 h。

2.2 活性研究

以水為溶劑，將1和 2配成c=3.0 mg·mL-1，測定其對的清除率，結果見表5。從表5可見，陽性對照Vc的清除率為91.55%。1和2與Vc相比，對的清除率極低，同時川芎粗多糖硫酸酯化前后對的清除作用無明顯差異。

(2)對DPPH自由基的清除率

以水為溶劑，將1和2配成c=3 mg·mL-1，c(Vc)=0.05 mg·mL-1，其對 DPPH 自由基的清除率見表5。從表5可見，1和21，24，26～29對DPPH自由基有一定的清除作用，但效果都遠遠低于陽性對照Vc。1的清除率大于21～28，說明經硫酸酯化修飾的川芎粗多糖其活性并非一定會提高。

從表5可見，29的DS最大(1.761 6)，其清除率也最高，但不能說明取代度與清除率之間呈正相關關系。

表5 1和2對和DPPH的清除率*Table 5 Clearance rate of 1 and 2 to and DPPH

表5 1和2對和DPPH的清除率*Table 5 Clearance rate of 1 and 2 to and DPPH

*1和2 的 c為3.0 mg·mL-1

96 0.68 91.55清除率(DPPH)/% 17.17 0.43 -9.35 6.96 -3.16 7.52 8.25 16.02 35.44 27.91 20.39 93.66 DS 0.162 2 0.441 8 0.375 8 0.958 9 0.382 7 0.538 9 0.7 Vc清除率(O-)/% -5.07 5.75 1.37 1.23 1.37 2.74 3.29 3.42 2.60 0.Comp 21 22 23 24 25 26 27 28 29 210 1 34 8 0.282 3 1.761 6 0.288 5 - -

3 結論

吡喃型糖通常以氯磺酸-吡啶法進行硫酸酯化修飾［12］。本文采用氯磺酸-吡啶法制備硫酸酯化川芎多糖，并以取代度為考察指標，通過單因素實驗優(yōu)化酯化反應條件為吡啶與氯磺酸體積比為4∶1，反應時間為3 h，反應溫度為70℃。

多糖分子通過引入硫酸酯基團所引起的多糖立體結構和理化性質的變化是引起硫酸酯化多糖生物活性變化的重要原因。相對于本文所采用的川芎粗多糖及其硫酸酯化產物而言，川芎粗多糖經過分離純化操作所獲得的單一川芎多糖組分及其硫酸酯化川芎多糖的相關研究還有待進一步探討。

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