Gemini表面活性劑對類脂囊泡理化性質及pH敏感性的影響＊

王慧云

（濟寧醫學院藥學院，山東日照276826）

由于人體病理組織如炎癥或感染區域，某些腫瘤組織或局部缺血時會出現異常酸化現象，從而導致了其pH值較正常組織的pH偏低[1－4]?；诖松硖攸cpH敏感藥物傳遞系統應運而生，它可以通過環境pH值的變化，實現藥物的控制釋放，或者根據病變部位與機體正常生理狀態pH值差別而實現靶向給藥[5]，減少藥物的不良反應[6－7]，其研究和應用近年來受到了國內外的廣泛關注[8－9]。其中pH敏感類脂囊泡由于其具有較pH敏感脂質體更高的穩定性而成為新型藥物傳遞系統領域的一大亮點[10]。pH敏感類脂囊泡的制備通常由非離子表面活性劑與膽固醇及pH敏感物質共同組成[11－16]。非離子Gemini由2個親水基和2個疏水基構成的一類新型表面活性劑，具有高表面活性、生物安全性及傳統表面活性劑良好的協同作用等特點[17－18]。然而關于非離子Gemini表面活性劑對類脂囊泡理化性質及pH敏感性和穩定性的影響較少報道。本文利用Gemini表面活性劑與Tween 20膽固醇、膽固醇半琥珀酸酯為囊材制備了pH敏感類脂囊泡，考察了Gemini表面活性劑對囊泡穩定性及pH敏感性的影響，旨在開發新型pH敏感藥物傳遞系統及拓寬Gemini表面活性劑的應用領域。

1 實驗部分

1.1 儀器與藥品

1.1.1 儀器 JY92－Ⅱ超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；2X－2型旋片式真空泵（南京市真空泵廠）；8010型攪拌式超濾杯（MILLIPORE COMPANY）；RE－52AA渦旋混合器（上海亞榮生化儀器廠）；旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；循環水真空泵（鄭州市長城科工貿有限公司）；Zetasizer Nano ZS90（英國，Malvern）；F－4600熒光分光光度計（Hitachi High－Technolodies Corporation Tokyo Japa）；LC－10AT高效液相色譜儀（日本島津株式會社）；N－2000雙通道色譜工作站（浙江大學智能信息程研究所有限公司）；ZRS－8G智能溶出試驗儀（天津大學無線電廠）。

1.1.2 藥品 吐溫20（上海山浦化工有限公司）；2，4，7，9－tetramethyl－5－decyne－4，7－diol ethoxylate（Gemini表面活性劑）（Sigma－Aldrich）；膽固醇半琥珀酸酯（CHEMS）（Sigma）；膽固醇（CHOL）（AR，上海藍季科技發展有限公司）；8－羥基－1，3，6－芘三磺酸三鈉（HPTS）（sigma）；胎牛血清（上海勁馬生物科技有限公司）；三氯甲烷（AR，江蘇南京中山集團公司化工廠）；甲醇（AR，江蘇南京中山集團公司化工廠）；醋酸緩沖溶液（pH 5.4，北京百匯生物科技有限責任公司）；磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4，LR，北京索寶生物科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 pH敏感類脂囊泡的制備與純化 采用薄膜水化—超聲法制備制備pH敏感類脂囊泡，取適量的表面活性劑Tween20、Gemini與膽固醇以及pH敏感物質膽甾醇半琥珀酸酯按照一定的配比溶于氯仿和甲醇的混合液中，使其溶解，利用旋轉蒸發儀于適當溫度下旋轉蒸發成膜，然后加入含有熒光探針HPTS的緩沖溶液水化，將得到的混懸液于常溫水浴中超聲處理5min（超聲功率400 W，間隔3s，工作3s），即得到pH敏感型HPTS囊泡混懸液。囊泡的純化：應用美國MILLIPORE公司的攪拌式超濾杯，加入囊泡混懸液后，向容器內通入氮氣提高超濾壓力，同時開啟磁力攪拌，游離藥物和溶劑分子被擠壓排出超濾膜外。

1.2.2 囊泡粒度和zeta電位的測定 利用動態光散射（DLS）測定囊泡大小及電位：將囊泡混懸液超聲處理后，用緩沖溶液稀釋，再經微孔濾膜過濾后，放入Zetasizer Nano ZS 90納米粒度zeta電位分析儀樣品池中，于25℃，散射角為90.0°條件下測定囊泡大小及分散指數。將樣品放入U型樣品池中測其zeta電位。

1.2.3 囊泡包封率的測定 將載藥囊泡用磷酸鹽緩沖液水化，超聲混勻，立即倒入超濾杯進行超濾，取出濾液，用HPLC進行測量，此濃度為C剩余，即未包入囊泡的游離藥物，求出樣品中未包入囊泡的藥物的質量D剩余，再求出藥品中投入藥物總量D總，代入下式即可求出包封率。

高效液相參數：色譜柱為C18色譜柱（250mm ×4.6mm，5μm）。流動相為甲醇和磷酸鹽緩沖液，二者體積比為50∶50，超聲0.5h脫氣。紫外檢測波長246nm，流速1.0ml／min。進樣量20μl，柱溫為室溫。

1.2.4 囊泡形態的測定 取囊泡混懸液少許滴于載玻片上，加蓋玻片，加1滴香柏油，于光學顯微鏡下觀察，接數碼相機拍照。囊泡在顯微鏡下的形態如圖1所示。

圖1 囊泡的光學顯微鏡照片（×4000）

由圖1可見，所制得的類脂囊泡為球形，具有明顯的雙層膜結構。

1.2.5 類脂囊泡體外pH敏感性的考察 載藥囊泡在不同pH環境中釋放速率：將超濾后的囊泡放入透析袋中，然后放入裝有250ml pH7.4或pH5.4的緩沖溶液的智能溶出儀燒杯中，透析袋置于攪拌漿的下端，設定溫度為37℃，轉速為50 r／min，模擬體內環境進行藥物緩釋性實驗。于1～8h每小時取樣1次，吸取釋放液5ml，同時補充5ml緩沖溶液。釋放液用高效液相色譜法檢測峰面積，從而求得HPTS的累積釋放度。

血清對類脂囊泡穩定性和pH敏感性的影響：將適量pH敏感類脂囊泡混懸液加入含有50%胎牛血清的緩沖溶液中，培育2h后用pH＝7.4的PBS緩沖溶液和pH＝5.4的醋酸緩沖溶液稀釋100倍，然后利用F－4600熒光分光光度計測定其熒光強度，溫度25℃、發射波長為510nm，用2.5nm的狹縫寬度，在300～600nm范圍內以10nm／min的速度掃描，掃面出最大激發波長后，再固定激發波長。通過測定不同pH下囊泡的熒光強度及包載物質的累積釋放量來考察囊泡的pH敏感性。

1.3 各因素對類脂囊泡的影響

1.3.1 CHEMS對類脂囊泡理化性質及包封率的影響 文獻[19]報道，在非離子表面活性劑囊泡的制備中加入CHEMS可改變膜的流動性，該功能與加入膽固醇相似，因此在實驗中保持膽固醇和CHEMS的總量不變，但改變膽固醇和CHEMS的比例，考察不同pH下CHEMS對囊泡理化性質及包封率的影響。Tween 20∶Gemini∶（CHOL＋CHEMS）為0.5∶0.5∶1.

1.3.2 Gemini表面活性劑對類脂囊泡理化性質及包封率的影響 固定Tween 20、膽固醇、CHEMS的量（分別為100nmol、50nmol、50nmol），考察不同Gemini表面活性劑的量分別（0nmol、20nmol、40nmol、60nmol、80nmol、100nmol、150nmol）對囊泡理化性質及包封率的影響。

1.3.3 Gemini表面活性劑對類脂囊泡pH敏感性的影響 篩選出一定配比的囊泡體系，分別考察不同pH下含有及不含Gemini表面活性劑的囊泡體系所包載物質的釋放行為及粒度變化，并進一步考察胎牛血清蛋白對該類囊泡體系穩定性及pH敏感性的影響。

2 結果與討論

2.1 CHEMS對類脂囊泡理化性質及包封率的影響

CHEMS對類脂囊泡粒度、分布指數、電位及包封率的影響，結果見表1。

表1 不同pH條件下CHEMS對囊泡粒度、zeta電位、PDI的影響

由表1可見，修飾有CHEMS的囊泡粒度大小及表面電荷明顯收到pH的影響，但在相同pH條件下，隨CHEMS量的增加粒度變化并不顯著，但電位明顯隨CHEMS的增加而增加。相同CHEMS含量條件下，囊泡的粒徑隨pH的降低而增加，電位隨pH降低顯著減小，PDI也隨pH的降低而增加，說明加入CHEMS后囊泡在較低pH條件下穩定性降低。這是由于CHEMS是一種pH敏感分子，當處于酸性環境中時，由于CHEMS的極性頭基發生質子化或水化，從而降低了zeta電位及脂質膜的穩定性，膜失穩后可能導致兩親性分子的重組，電位的降低將導致囊泡的聚集，從而使得其粒度及分布系數有較大變化。

2.2 Gemini表面活性劑對類脂囊泡理化性質及包封率的影響

Gemini表面活性劑對類脂囊泡理化性質及包封率的影響結果見表2。

表2 Gemini表面活性劑對pH敏感類脂囊泡粒度、PDI、電位及包封率的影響

由表2可見，隨Gemini表面活性劑用量的增加，體系粒度值略有增加，zeta電位并沒有發生明顯變化，但PDI值變化較明顯，隨Gemini表面活性劑用量的增加PDI總體變化趨勢是先降低后增加，體系的包封率也隨著Gemini表面活性劑用量的增加而增加，但增加到一定值后基本不再發生明顯變化，甚至略有降低。

出現這些現象的原因可能是，這可能是由于非離子Gemini表面活性劑具2個親水基和2個疏水基，有較強的表面活性，分散能力較傳統表面活性劑強，且連接基團插入囊泡雙層膜中進一步增加了膜的穩定性，從而增加了其包封率及粒度分布的均勻性。當濃度過高時，由于Gemini表面活性劑的強分散能力，使其與Tween 20及膽固醇／膽甾醇半琥珀酸酯之間的協同成膜能力降低，包封率隨Gemini表面活性劑濃度的增加反而降低。

2.3 Gemini表面活性劑對類脂囊泡pH敏感性的影響

選擇處方為Tween20 50nmol、膽固醇50nmol CHEMS 50nmol、Gemini 50nmol囊泡體系，分別將其放入pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液及pH5.4的醋酸緩沖溶液中，測定HPTS在不同pH條件下的累積釋放曲線。結果見圖2。

圖2 類脂囊泡體系在不同pH條件下的釋藥行為

由圖2可見：2種pH敏感類脂囊泡在較低pH條件下藥物快速釋放，而不含CHEMS的類脂囊泡，HPTS釋放較慢，對藥物具有一定緩釋作用。含有Gemini表面活性劑的類脂囊泡其釋放速率在2種pH條件下均較不含Gemini體系略低，可能是由于在實驗條件下，Gemini表面活性劑與處方中其他處分間產生協同效應，從而使得類脂囊泡的膜更緊密，從而導致了其釋放速率減小，但從圖中可見，Gemini表面活性劑的存在對類脂囊泡的pH敏感度影響不大。

胎牛血清對含Gemini表面活性劑pH敏感類脂囊泡穩定性及pH敏感度的影響結果見圖3。

圖3 pH敏感類脂囊泡在不同pH值下的熒光強度與隨pH值的變化

由圖3可見，經過胎牛血清培育2h后，pH敏感類脂囊泡在較低pH下，熒光強度顯著降低，說明體系仍具有較好的pH敏感性。相對來說，含有Gemini表面活性劑的pH敏感類脂囊泡，經過牛血清培育后其pH敏感程度相對不含Gemini體系來說略有降低，但影響不是太大?？赡苁怯捎贕emini表面活性劑與處方中其他成分存在較強的協同效應，構成的雙層膜的穩定性較強，從而使得熒光物質不宜泄漏，故其在較低pH條件下，囊泡的熒光強度高于pH敏感非離子表面活性劑囊泡體系。

3 結論

Tween 20表面活性劑與2，4，7，9－tetramethyl－5－decyne－4，7－diol ethoxylate（Gemini表面活性劑）、膽固醇、膽固醇半琥珀酸酯可形成粒度大小合適、分布均勻、包封率高、pH敏感性強的類脂囊泡，CHEMS的加入，對囊泡的粒度沒有明顯影響，但卻可顯著增加其zeta電位和pH敏感性。Gemini可增加pH敏感類脂囊泡的均勻度及包封率，對其pH敏感性影響不大，因此pH敏感Gemini類脂囊泡將成為一種非常有潛力的靶向藥物傳遞系統。

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