標記基因對土壤微生物潛在影響的研究進展

洪求枝 （長江大學工程技術學院，湖北 荊州434020）

標記基因可為獲得真正的轉化體提供判斷依據，在植物遺傳轉化中發揮著至關重要的作用。自1983年第一株轉基因植物誕生以來，所有正在進行的田間試驗和被批準進行商業化應用的轉基因植物幾乎都含有標記基因。然而，標記基因在為轉基因植物篩選帶來便利的同時，有人擔心其表達產物可能對生態環境和人類健康產生一定的影響。為此，筆者就轉基因植物中常用的標記基因及其對土壤微生物潛在影響的研究進展進行了綜述。

1 標記基因的研究

選擇標記基因 （selectable marker gene）簡稱標記基因 （marker gene），是一些已知效應的基因，它能夠使個體具備特定的特征并且通過生理學、形態學、生物化學或分子生物學手段檢測其存在且效果明顯的基因，這些標記基因在轉化過程中起到重要作用。目前絕大部分植物的轉基因需要融合標記基因，以便于檢測。轉基因研究中普遍應用的抗性標記基因在植物轉化過程中是很有利的選擇工具，可大大減少區分轉化和非轉化細胞的工作量。

1．1 常用的標記基因及作用

根據標記基因的功能，可將其分為選擇基因和報告基因2類［1］。選擇基因的編碼產物可使細胞或組織具有除草劑或抗生素的抗性，或者具有代謝優越性。當環境中存在抗生素或除草劑等選擇試劑時，轉化的細胞或植株能夠存活從而被篩選出來。報告基因是指其編碼產物能夠被快速測定、且不依賴于外界壓力的一類基因。目前常用的報告基因大多是一些酶基因，如氯霉素乙酰轉移酶基因 （cat）、熒光素酶基因 （luc）、β-葡萄糖苷酸酶基因 （gus）等。

植物轉基因研究中使用較多的是選擇基因，選擇基因可以分為2類：即抗生素類選擇基因和抗除草劑類選擇基因［2］。

抗生素類選擇基因，如對卡那霉素、G28、巴龍霉素和新霉素有抗性的新霉素磷酸轉移酶基因（npt），氯霉素抗性的氯霉素乙轉移酶基因 （cat），鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸轉移酶基因 （Spt），潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉移酶基因 （aphV）及慶大霉素和博來霉素抗性基因等。其中卡那霉素抗性基因是在植物基因轉化上最早也最常用的顯性選擇標記，潮霉素抗性基因也是目前較常用的標記基因［1］。

卡那霉素抗性基因的標記原理是以nptII基因作為遺傳標記基因，該基因編碼的新霉素磷酸轉移酶II能使植物產生抗卡那霉素特性［3］，故可用卡那霉素對轉化的植株進行篩選，已報道的方法主要用在田間對棉花葉片涂抹卡那霉素進行檢測［4-8］。

潮霉素對應的標記基因主要為潮霉素磷酸轉移酶基因 （aphⅣ），利用農桿菌轉導法將重組基因轉入植物細胞［9］。潮霉素抗性基因還可以分為aph（4）-Ia（或hph）基因及aph（4）-Ib（或hyg）基因，又稱hpt。實驗證明hpt基因是單子葉植物較為理想的篩選基因，其優點有：選擇效率高、基因型差異小、對轉化細胞不產生或很少產生毒害作用、再生的轉基因植株育性較好等［10］。目前，hpt基因在水稻、玉米和小麥等作物上有著廣泛應用，大多數轉基因水稻的有關研究都以其為選擇標記。

1．2 標記基因的潛在風險

標記基因在為轉化植株的篩選提供了方便，但選擇標記基因在完成篩選、得到所需要的轉化植株之后失去了利用價值，甚至有潛在危害，其危害性主要包括食品和環境2方面：（1）食品安全性方面。標記基因可能被轉入人與動物的腸道微生物和上皮細胞，從而降低抗生素在臨床治療中的效用。標記基因的表達產物也可能對人與動物的肌體產生一定影響［11］。（2）環境安全方面。標記基因涉及到的環境安全問題則主要有：編碼抗生素或除草劑的標記基因可能發生漂移，進入野生親緣種中，產生具有抗性的“超級雜草”。轉入標記基因的植物可能對環境中其他動植物產生選擇，從而改變生態組成，破壞生態平衡［12］。標記基因表達產物可能對環境中動植物和微生物產生選擇，從而改變生態組成。標記基因可能轉移到微生物中，導致土壤中超級細菌的產生，對土壤生態系統造成破壞。

1．3 解決標記基因安全性問題途徑

可以通過回避或剔除標記基因以及發展安全標記基因等方法來解決標記基因的安全性問題。之所以要剔除標記基因，一方面是因為轉基因植物一旦再生成功，標記基因便不再有用；另一方面，基因轉化系統中一些輔助序列 （包括標記基因）的消除可以減少同源區序列造成的遺傳不穩定［13-15］。目前，比較有效的標記基因剔除系統主要有：雙T-DNA載體共轉化系統、轉座子系統、位點專一性重組系統和染色體內同源重組系統［16］。

安全標記基因多來自于植物本身，不會破壞生態平衡。國內有報道［17］磷酸甘露糖異構酶基因、木糖異構酶基因、綠色熒光蛋白基因等6種基因可代替傳統的抗性標記基因，實現植物轉化無害化。

2 標記基因作物對土壤微生態的影響

土壤微生態系統包括土壤微生物種類與數量、土壤理化性質、土壤養分的釋放及有效性等，是地球生態系統物質與能量循環的重要場所與組成部分。有研究表明，改變土壤微生物群落將影響土壤微生物呼吸速率及其溫度敏感性，從而間接影響全球氣候變化趨勢［18-19］。也有研究證實標記基因作物中轉Bt基因棉花和馬鈴薯的根系分泌物對其根際微生物在數量方面與對照間差異不顯著［20-22］。

2．1 標記基因產物進入土壤的途徑

標記基因產物進入土壤的途徑是多種多樣的，其中最直接的途徑包括植株殘茬分解、根系分泌以及花粉落入。這些進入土壤生態系統的標記基因表達產物都可能對土壤生態系統產生影響［23］，進而對整個生態系統產生影響。

2．2 標記基因表達產物對土壤微生物群落的影響

土壤微生物是重要的分解者，將土壤中有機養分轉化為無機養分，以利于植物的吸收利用。合理利用土壤微生物可以提高農作物產量、保護瀕危植物、恢復退化植被和修復被污染的土壤［24］。導入作物中的外源基因及其所表達的蛋白可通過作物殘體、根系脫落物和分泌物等進入土壤，對土壤環境的生態平衡產生長遠的影響，進而影響土壤微生物、昆蟲、軟體動物的分布等［25］。而植物基因轉化中的選擇標記基因亦屬于外源基因，理論上也極有可能對土壤微生物造成影響，而且由于大多數轉基因育種仍然依賴于選擇標記基因，故研究標記基因對土壤微生物的影響尤為重要，目前很少有報道研究這方面內容，以前的研究依然集中在以轉基因玉米、棉花、水稻、大豆、油菜等植物個體為實驗對象的水平上。因此，標記基因對土壤微生物的影響有待進一步地研究。

2．3 標記基因表達產物對土壤微生物種類和數量的影響

標記基因會同目標基因一起整合到植物基因組中，通過重組、轉導、轉化等途徑在微生物之間相互轉移。另外，標記基因跟其他基因一樣，進入植物基因組后，會破壞基因組的完整性，所以轉標記基因的植株一般也會變小、花期延長、育性一般也會降低。在地下部分，轉標記基因的作物在根尖有時會有分泌物，這些分泌物可能會對土壤中的微生物造成影響，尤其是其種類和數量Donegan等［26］就轉蛋白酶抑制劑基因煙草對土壤微生物種類和數量的潛在影響進行了研究，結果發現轉基因植物根際土壤中存在更多的線蟲，而Collembola的數量則顯著降低。

3 結語

篩選標記在植物遺傳轉化中極為重要，但在完成篩選的使命后也可能給環境帶來不利的影響。通過研究標記基因對土壤微生物的影響來考察其土壤環境安全性將有助于更好地了解標記基因，更安全地應用標記基因，并為其應用和使用后環境安全問題的解決提供參考，為轉基因作物的大規模推廣應用的安全評估提供基礎。

［1］陸曉春，郭長英，胡守榮．轉基因植物中的標記基因 ［J］．東北農業大學學報，2000，31（1）：86-90．

［2］李桂玲，李明澤，劉宗華，等．轉Bt基因抗蟲玉米的研究 ［J］．生物技術通報，2009（5）：9-13．

［3］張慧軍，石躍進，朱永紅，等．NPTII標記轉基因棉花再生株的延期篩選 ［J］．中國棉花，2002，29（5）：26-27．

［4］周 玉，王留明，張學坤，等．轉基因抗蟲棉田間快速鑒定方法研究 ［J］．山東農業科學，2000（1）：48-49．

［6］李燕娥，焦改麗，李淑君，等．轉基因棉花純度快速測定法 ［J］．中國棉花，1998，25（8）：14-18．

［7］吳家和，張獻龍，羅曉麗，等．轉新型雙抗蟲基因棉花的遺傳分析 ［J］．遺傳學報，2003，30（7）：631-636．

［8］康保珊，張 銳，潘登奎，等．轉基因雙價抗蟲棉中CrylAc基因與CpTI基因的共表達 ［J］．棉花學報，2005，17（3）：131-136．

［9］劉巧泉，陳秀花，王興穩，等．一種快速檢測轉基因水稻中潮霉素抗性的簡易方法 ［J］．農業生物技術學報，2001，9（3）：264-268．

［10］王相春，程在全，曾千春，等．植物篩選標記基因應用進展 ［J］．安徽農業科學，2011，39（22）：13290-13291．

［11］周 巖，游 建．植物基因工程—標記基因的安全利用 ［J］．生物技術通報，2012，（7）：7-13．

［12］劉苗霞，張顏睿，付鳳玲．標記基因在植物轉基因中的安全性研究 ［J］．安徽農業科學，2011，39（28）：17186-17187．

［13］侯愛菊，朱延明，張 晶，等．轉基因植物中篩選標記基因的利用及消除 ［J］．遺傳，2003，25（4）：466-470．

［14］石 君，吳忠義，黃叢林，等．利用Cre／loxP系統和rd29A啟動子構建誘導型植物標記基因刪除載體 ［J］．分子植物育種，2009，7 （5）：1040-1044．

［15］Holger Puchta．Removing selectable marker genes：taking shortcut［J］．Trends in Plant Sci，2000，5 （7）：273-274．

［16］劉香利，趙惠賢，郭藹光．位點特異性重組及其在剔除植物篩選標記基因中的應用 ［J］．農業生物技術學報，2010，18（3）：597-603．

［17］劉廣金，姚曉林，蔣家平，等．轉基因植物中安全標記基因的研究進展 ［J］．現代農業科技，2008（4）：208-210．

［18］畢江濤，賀達漢．植物對土壤微生物多樣性的影響研究進展 ［J］．中國農學通報，2009，25（9）：244-250．

［19］范分良，黃平容，唐勇軍，等．微生物群落對土壤微生物呼吸速率及其溫度敏感性的影響 ［J］．環境科學，2012，33（3）：932-937．

［20］Sabharwal N，Icoz I，Saxena D，et al．Release of recombinan proteins，human serum albumin，β-glucuronidase，glycoprotein B from human cytomegalovirus，and green fluorescent protein in root exudate from transgenic tobacco and their effects on microbes and enzymatic activities in soil［J］．Plant Physiology and Biochemistry，2007，45：464-469．

［21］Shen R F，Cai H，Gong W H．Transgenic Bt cotton has no apparent effect on enzymatic activities or functional diversity of microbial communities in rhizosphere soil［J］．Plant and Soil，2006，285：149-159．

［22］Park S，Ku Y K，Seo M J，et al．Principal component analysis and discriminant analysis（PCA-DA）for discriminating profiles of terminal restriction fragment length polymorphism （T-RFLP）in soil bacterial communities ［J］．Soil Biology and Biochemistry，2006，38：2344-2349．

［23］Saxena D，Flores S，Stotzky G．Bt toxin is released in root exudates from 12transgenic cornhybrids representing three transformation events［J］．Soil Biology and Biochemistry，2002，34：133-137．

［24］趙官成，梁 健，淡靜雅，等．土壤微生物與植物關系研究進展 ［J］．西南林業大學學報，2011，31（1）：83-88．

［25］羅玉秀，杜德志，羅淑英．轉基因植物及其對生態環境的影響 ［J］．青海環境，2008，18（2）：66-69．

［26］Donegan K K．Beidler R J，Fieland V J．Decomposition of genetically engineered tobacco under field conditions：persisitence of the proteinase inhibitor product and effects on soil microbal respiration and protozoa，and microarthropod populations［J］．J Appl Ecol，34：767-777．