金黃色葡萄球菌腸毒素C的骨科應(yīng)用研究進(jìn)展

董晨輝，王子明，王愛民

金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)是一種具有極強(qiáng)致病性的人畜共患病病原微生物，已經(jīng)有100多年的歷史［1－2］;金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxins，SEs)是一類由金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的外毒素，屬于典型的超抗原。

1 金黃色葡萄球菌腸毒素的超抗原特性及其經(jīng)食物傳播引起的疾病

金黃色葡萄球菌腸毒素(SEs)是屬于金葡球菌和鏈球菌產(chǎn)生的家族龐大的致熱腸毒素，由金黃色葡萄球菌編碼形成的蛋白質(zhì)分子，不需要抗原提呈細(xì)胞(Antigen-presenting cells，APC)處理而直接與主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complexⅡ，MHCⅡ)類分子結(jié)合，導(dǎo)致帶有特異性V節(jié)段的CD4+T細(xì)胞大量增殖。其對T淋巴細(xì)胞的刺激能力是普通抗原的2 000～5 0000倍，在極低濃度時即可產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫反應(yīng)［1－3］。

SEs作為一種超抗原(superantigen，SAg)，對T淋巴細(xì)胞具有很強(qiáng)的刺激作用，是目前已知的人淋巴細(xì)胞最強(qiáng)的刺激劑和最有力的一種細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑;它同時是第1個被認(rèn)識和廣泛研究的SAg，也是目前研究最多、臨床使用最為廣泛的SAg［4］。通過SEC2依賴的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒作用，少量的SEC2可以激活大量的淋巴細(xì)胞。只要有極低濃度(10～12mmol/L)的SEC2就能與白細(xì)胞的MHCII類分子結(jié)合，可激活大部分含有T細(xì)胞受體β肽鏈可變區(qū)(T cells receptor Vβ，TCR-Vβ)的 T細(xì)胞(主要包括 CD4+、CD8+的T細(xì)胞)增殖，并使之釋放多種細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子中可能含有具有促成骨效應(yīng)(osteotropic effects)的生長因子，如具有絲裂效應(yīng)的胰島素樣生長因子(IGF-I)，成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-2)和血小板衍生生長因子BB(Platelet-derived growth factor，PDGF-BB)，增加骨細(xì)胞活性的轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β及骨誘導(dǎo)作用的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMPs等;Antigen-presenting cells，在細(xì)胞免疫反應(yīng)中，細(xì)胞膜結(jié)合T細(xì)胞抗原受體(T cell antigen receptor，TCR)起著至關(guān)重要的作用［4－5］。TCR 是一種糖基化多聚異二聚體，由α、β、γ、δ 4條鏈構(gòu)成，抗原與TCR結(jié)合，并且與組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)綁定，被抗原提呈細(xì)胞(Antigen-presenting cells，APC)發(fā)現(xiàn)，與APC細(xì)胞膜上的特異蛋白可與超抗原以及T細(xì)胞發(fā)生非特異性結(jié)合，最終刺激免疫細(xì)胞的大量生成;這種類型的免疫反應(yīng)識別存在著高度的專一性，僅有一小部分的T細(xì)胞能夠識別這種特異抗原。在很大程度上，超抗原能夠與T細(xì)胞發(fā)生很多非特異性反應(yīng)，而且可以最大限度的激活T淋巴細(xì)胞，而且超抗原接受相互反應(yīng)以及連鎖反應(yīng)的T細(xì)胞受體只能識別特異TCR-Vβ和抗原提呈細(xì)胞的MHC-Ⅱ型并發(fā)生反應(yīng)［6－7］。

對于抗原提呈細(xì)胞來說，SEs受體是MHCⅡ類分子限制分子;有報道顯示:金黃色葡萄球菌腸毒素復(fù)合物和MHCⅡ類分子必須在T細(xì)胞抗原受體的β鏈上的特異區(qū)域結(jié)合［8］，這對SE的后續(xù)分子水平的研究有著重要的意義。

SE誘導(dǎo)有絲分裂的活性依賴于聚集白細(xì)胞介素-6(IL-6)的能力，這與SEs的毒性有著密切的關(guān)系。近年來，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒越來越多，據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心相關(guān)報告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第2位，僅次于大腸桿菌。金黃色葡萄球菌腸毒素是個世界性衛(wèi)生問題，研究表明，SEB引起的食物中毒，通常是以牛奶為中間媒介導(dǎo)致食物中毒的發(fā)生［9］。多起的金葡球菌引起的食物中毒中，SEA的檢出率達(dá)到了95%以上，少數(shù)查出金黃色等［5－8］;最近的報告顯示:蘑菇中的SEA在環(huán)境溫度121℃中持續(xù)28min(或者在128℃持續(xù)15min)依然具有生物活性，動物實(shí)驗(yàn)中依然可以使動物致病［9－13］。因此，必須加強(qiáng)食品衛(wèi)生法和食品衛(wèi)生知識的宣傳，加強(qiáng)食品衛(wèi)生的監(jiān)督工作，可以有效防止食物中毒的發(fā)生。

2 金葡球菌腸毒素C在骨科的應(yīng)用及前景分析

當(dāng)今社會的創(chuàng)傷大多傷情嚴(yán)重且失血量大，尤其是失血性休克以及全身多發(fā)骨折等嚴(yán)重患者需要盡快輸血，改善循環(huán)，從而獲得近期理想的救治效果。據(jù)何靜等［14］報道4913例急性創(chuàng)傷患者中，包括60%存在不同程度的骨折。但是骨折的后期治療相當(dāng)?shù)膹?fù)雜，手術(shù)的風(fēng)險評估［15］，特別是老年患者的手術(shù)救治。蘭秀夫等［16］關(guān)于760例骨科老年患者手術(shù)風(fēng)險因素分析中，報道56.7%的骨科老年患者存在不同程度的并發(fā)癥，術(shù)后死亡率為2.1%;在23.3%住院患者術(shù)后出現(xiàn)1個或1個以上的并發(fā)癥，其中包括失血性休克(3例)，肺栓塞(3例)，心肺功能衰竭(5例)以及腦血管意外(3例)和感染(32例)等，這些都是難以避免的臨床問題，因此在此研究中，發(fā)現(xiàn)一種能夠安全應(yīng)用的骨折損傷修復(fù)類用藥是很必要的。在金葡素注射液的臨床應(yīng)用中，得到了很多良好的療效，因此進(jìn)一步研究其藥理機(jī)制是必不可少。

在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌(金葡菌)是臨床上引起化膿性感染的常見革蘭陽性菌，其致病機(jī)制與其能分泌多種胞外酶和外毒素有關(guān)。有多個二元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)參與了這些毒力因子的表達(dá)調(diào)控，其中二元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)AGR是最重要的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)。大批學(xué)者也在進(jìn)一步研究這些方面的問題金黃色葡萄球菌腸毒素C(SEC)是SEs中特殊的一類，分為SEC1、SEC2和SEC3等幾種亞型，這3亞型之間蛋白質(zhì)分子羧基端存在高度保守，氨基酸的相似度更是達(dá)到了95%以上，然而只在2個氨基端略有差。亞型間分子上的關(guān)聯(lián)度與免疫學(xué)的關(guān)聯(lián)度相對應(yīng)．可以推斷SEC氨基端決定了亞型間的特異性抗原決定簇，而高度保守的羧基端決定了SEC的生物學(xué)活性和亞型間免疫交叉反應(yīng)的抗原決定簇。

SEs的氨基酸序列的一致性的比較中，基本在22% ～33%，可以推斷其功能上也都有其相似之處［17］?？梢?，SEs的所有成員，享有許多相同的保守結(jié)構(gòu)域，擁有著相似的β-折疊二級結(jié)構(gòu)的模體和一個β-轉(zhuǎn)角模體，兩個模體被一個淺溝隔開［9］，而這兩個模體之間連接點(diǎn)的序列則存在著高度保守的特性［1，11］，因此，可以推測 SES的致病機(jī)理存在共性。近來，應(yīng)躍斌等［18］利用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)從金黃色葡萄球菌的基因組DNA中克隆SEC2全長基因，PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，經(jīng)測序證實(shí)后進(jìn)行亞克隆，構(gòu)建其表達(dá)載體pET-28a-SEC2，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)成熟重組并純化rSEC2蛋白后，在對SEC2分子生物學(xué)活性以及臨床應(yīng)用上的研究就更加簡便快捷。

近年來，研究證實(shí)，金黃色葡萄球菌分泌產(chǎn)生的相關(guān)蛋白分子質(zhì)量主要在100ku之下，而SEC2分子質(zhì)量在28ku左右，一共有239個氨基酸組成的蛋白質(zhì)小分子［19］;盡管SEs作為一種超抗原的行為模式被廣為人知，但是很少有研究表明，SEs是如何穿過腸壁進(jìn)入機(jī)體并且引起一系列的食物中毒事件。利用體外培養(yǎng)技術(shù)來研究人類小腸表皮細(xì)胞抑制MHCⅡ類分子途徑情況下進(jìn)行金葡球菌毒素的感染，發(fā)現(xiàn)表皮細(xì)胞有能力促進(jìn)胞吞SEB和TSST-1的作用，而非SEA。在小鼠的體內(nèi)試驗(yàn)中看出，通過攝入SEs，血液中SEB的檢出率明顯遠(yuǎn)高過SEA;因此，可以得出，金葡球菌腸毒素是可以通過小腸表皮細(xì)胞進(jìn)入機(jī)體，并導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床癥狀。

在臨床應(yīng)用中，金葡素注射液應(yīng)用于骨科患者，得到了一定的療效。全身應(yīng)用和在骨折斷端或骨不連接處局部注射金葡素注射液有利于骨折的愈合，這其中發(fā)揮作用的主要成分是SEC2［20］。對于金葡液的主要有效成分的分析研究證明，SEC2在臨床治療腫瘤和其超抗原活性中都表現(xiàn)為主要的作用，因此在SEC2是否能夠誘導(dǎo)成骨方面也有待研究證實(shí)，但臨床應(yīng)用金葡液治療骨缺損、骨不連等疾病時，金葡液所表現(xiàn)出的良好效果已經(jīng)有了很好的例證［18－24］;Wei等［18］制作出羥基磷灰石－纖維蛋白黏合劑-金葡液復(fù)合物用于骨缺損模型，結(jié)果表明此復(fù)合物有很好的塑形作用，可以當(dāng)成一種新型的骨替代材料用于骨缺損患者的治療;朱亞軍等［23］利用RT聯(lián)合恩格菲治療癌癥骨轉(zhuǎn)移所致疼痛的效果明顯，骨痛分級按VRS分級法，有效率為95%患者(19/20);由于恩格菲主要有效成份是金黃色葡萄球菌腸毒素C2，不僅能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，并能刺激T細(xì)胞的增殖分化，誘發(fā)生物學(xué)放大效應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的溶解破壞;余建平等［26］通過將纖維蛋白膠-金葡液復(fù)合物植入骨缺損處作為實(shí)驗(yàn)組，初步探討金葡液以纖維蛋白膠為載體修復(fù)骨缺損模型，結(jié)果從細(xì)胞水平的研究發(fā)現(xiàn):金葡液以纖維蛋白膠為載體可以修復(fù)骨缺損，能減少金葡液的局部注射缺陷，提高其藥物療效;Tang等［27］研究發(fā)現(xiàn)，采用金葡液骨折端注射和谷康泰靈術(shù)后肌肉注射，預(yù)防發(fā)生骨不連，并設(shè)同期對照組，結(jié)果令人滿意。大量骨折后不延遲愈合和骨缺損的患者應(yīng)用金葡液也得到良好的效果［22－25］。因此，在金葡液成分的分析中，Ding等［28］研究中表明:金葡液中的有效成分中SEC2占主要的地位，并且在療效上起到?jīng)Q定性的作用。

對于金黃色葡萄球菌腸毒素C2的研究多集中于金葡液為主要方向，金葡液主要通過兩種途徑加快骨代謝，促進(jìn)骨的愈合，主要表現(xiàn)為:促進(jìn)毛細(xì)血管增生，改善局部血供;促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟。然而，金葡液中的主要成分SEC2作用于體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化功能;而主要存在的問題:聯(lián)合應(yīng)用抗壞血酸則會有更好的成骨作用，具體的機(jī)制仍不詳;并且在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，SEC2能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化和成熟，從而達(dá)到促進(jìn)成骨細(xì)胞生成，加速骨折的愈合，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步完善。因此，SEC2在骨科的應(yīng)用具有極大地前景，在分子機(jī)制上的研究還需要進(jìn)一步深入研究。

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