微生物菌種誘變篩選方法及其應用

許 翠，高夢祥 （長江大學生命科學學院，湖北 荊州434025）

微生物具有獨特和高效的生物轉化能力，能產生多種代謝產物，其產物中的一些生物活性物質 （如抗生素、氨基酸、糖肽等）在醫藥、食品和化工工業中有著不可取代的地位［1］。然而，通常從自然界分離得到的野生菌株代謝產物產量往往很低，遠不能滿足工業生產的需要，因此微生物應用的難題集中到如何對菌種進行改良，以獲得高產高效的優良工業菌株。而微生物育種的目的就是要人為地使某些代謝產物過量積累，把生物合成的代謝途徑朝著人們所希望的方向加以引導，獲得所需要的高產、優質和低耗的菌種［2］，以降低生產成本［3］。微生物誘變處理一般采取物理誘變方法，如紫外線 （UV）、X射線等和化學誘變方法如堿基類似物、烷化劑甲基磺酸乙酯 （EMS）等傳統方法。但是，這些方法具有耗時、費力、工作量大以及誘變結果不具定向性等缺點。隨著生命科學技術的發展以及學科交叉的深入，基因工程、原生質體融合和生物信息學等的應用日益廣泛，使得菌種改良技術得到了不斷的發展和創新，從而為篩選得到更多優質、高效菌種提供了技術上的可能和便利［4］。為此，筆者綜述了近年來國內外出現的微生物菌種誘變新技術以及新的篩選方法在微生物菌株選育中的應用，旨在為微生物菌種誘變篩選等相關研究提供啟迪和參考。

1 誘變育種技術

1．1 離子注入誘變育種

離子注入誘變是集物理誘變、化學誘變為一體的綜合誘變方法，1986年由中科院等離子體所率先將低能離子束技術應用于誘變育種［5］。該技術是利用離子注入設備對生物體進行離子注入，注入的離子對細胞的刻蝕可使細胞由表及里形成微孔或洞，生物分子吸收能量并引起多類活性自由基的復雜變化，從而引起染色體的畸變，導致DNA鏈堿基的損傷、斷裂［6］，最終導致遺傳物質的永久改變，然后從變異菌株中選育優良菌株。該技術應用于微生物誘變育種時具有損傷輕、突變率高、突變譜廣、變異幅度大、性狀穩定等特點［7］，其所選用的離子一般為氣體單質的正離子，其中以N＋最多，近年來在工業微生物優良株的誘變選育或改良中取得了較大的成功。李穎穎等［8］對新鮮靈芝孢子進行低能N＋注入，篩選到了1株靈芝高產菌株GL1026，其靈芝子實體產量、多糖含量、三萜含量分別較對照菌株提高了15．94%、9．68%、17．60%。王瑤函等［9］以鏈霉菌NJWGH1322為研究對象，利用N＋低能離子注入、亞硝酸鈉 （NaNO2）進行誘變，最終篩選出1株產量突變提高43．1%的高產菌株，經5次傳代試驗表明該菌株遺傳穩定性較好。陳麗娟等［10］以青貯玉米中選育獲得的植物乳桿菌ANCLA01作為出發菌株，采用單粒子精確定位注入技術對其進行氮離子注入，篩選獲得正向突變菌株ANCLA02，氮離子的注入使植物乳酸桿菌的共軛亞油酸 （CLA）產量從33．44μg／ml提高到66．67μg／ml，且變異菌株經傳5代培養后產CLA穩定。

1．2 原生質體融合育種

原生質體融合技術 （Protoplast fusion）是起源于20世紀60年代的一項重要的菌種改良技術，是將親株細胞分別去除細胞壁后在高滲條件下輔以物理、化學或生物手段進行融合，經基因組間的交換重組，獲得融合子的過程［11］。原生質體融合可以使親本細胞隨機融合，有效地篩選具有親本特性的優良融合菌株，為遺傳育種提供了一種有效手段，已廣泛應用于微生物育種工作的各個方面 （如高產菌株選育，多功能菌株選育等）。Xu等［12］以始旋鏈霉菌 （S．pristinaespira lis）CGMCC0957突變菌中普納霉素產量最高的4株菌為親本進行原生質體融合，得到的優良菌株的普納霉素產量達到0．89g／L，比親本高89．4%。Jin等［13］以10株產量較高的多殺菌素產生菌 （Saccharopolyspora spinosa）為出發菌株，經過融合，得到高產菌株4～7株，其產量可達到547mg／L，較出發菌株提高了200．55%以上，在5L發酵罐中發酵168h，多殺菌素產量可達到428mg／L。張歡等［14］以釀酒酵母Y518為出發菌種，基于多親本原生質體融合技術，通過4輪原生質體融合，得到2株GSH產量提高的釀酒酵母突變菌株，最高產量可達15．92mg／g，為原始菌株的2倍。張禹等［15］選取具有草酸分解能力的乳雙歧桿菌和具有耐氧特性的嗜酸乳桿菌作為親本，通過雙親滅活進行原生質體融合，融合率可達7．6%。從中篩選出同時具有耐氧特性和草酸分解能力的融合子，草酸分解率為13．4%。

1．3 基因工程誘變育種

基因工程育種是在分子水平上對基因進行操作，人為將所需的某一供體生物的遺傳物質提取出來，在離體條件下用適當的工具酶進行切割后，與載體連接，然后導入另一細胞，使外源遺傳物質在其中進行正常復制和表達［16］，從而獲得新物種的一種嶄新技術。該技術克服了傳統育種技術的隨機性和盲目性，可以完全突破物種間的障礙，進行定向變異和育種，在微生物菌種改良方面具有廣闊的應用前景。近年來，隨著基因工程和現代分子生物技術的快速發展與突破，基因組改組技術、基因敲除技術等新方法的應用也日益廣泛。

基因組改組技術又叫基因組重排 （genome shuffling）是近幾年發展起來的一種新型微生物體內分子育種方法，其通過傳統微生物誘變育種與原生質體融合技術的有效結合，使得不同菌株的全基因組進行隨機重組，進而極大提高菌種的正突變頻率，使得人們能夠在短時間內選育到理想菌株［17－18］。該技術應用時無需事先了解親本菌株詳細的遺傳背景即可實現微生物的定向進化［19］，使之成為了一種極其高效的微生物育種手段。王景會等［20］以4株誘變的枯草芽孢桿菌菌株為親本，采用PEG介導的方法進行兩次多親本的全基因組改組，共篩選出3株酶活力大幅度提高并能穩定遺傳的優良菌株，酶活力最高2175．81U／m L，達到原始菌株的3．01倍。王大紅等［21］以纖維堆囊菌AHB125為原始菌株，以經過紫外誘變和2%乙酸鈉抗性篩選出來的SC4－14和SC4－56為出發菌株，通過4輪基因組重排成功選育出了5株遺傳穩定的埃坡霉素B（Epothilone B）高產菌株，其中1株重排菌株F4－28埃坡霉素B產量達到67．4mg／L，是原始菌株產量的8倍，是兩親本菌株埃坡霉素B產量的4～5倍。

基因敲除 （gene knockout）是20世紀80年代發展起來的一項重要的分子生物學技術，其利用DNA轉化技術，將含有目的基因和靶基因同源片段的重組載體導入靶細胞，通過載體與靶細胞染色體上同源序列間的重組，將外源基因整合入內源基因組內，使外源基因得以表達［22］。隨著對微生物代謝機理認識的不斷加深，利用基因敲除技術可阻斷微生物細胞的代謝旁路，進行微生物基因的結構和功能相關研究，或通過引入突變位點降低或阻斷副產物的合成，提高產物的純度，從而改變目的產物的產量或質量，改良工業生產菌株，達到微生物育種的目的［23］。佐一含等［24］通過敲除啤酒酵母中β－丙基蘋果酸脫氫酶基因 （LEU2），篩選獲得的突變株發酵液中高級醇含量比出發菌株降低了9．97%，其中異戊醇的含量降低了11．82%，而酒精度、發酵速度等發酵性能沒有明顯變化。Steen等［25］在大腸桿菌K系列菌株中敲除了脂酰輔酶A合成酶的基因 （fad D和fad E基因），并過量表達大腸桿菌硫酯酶，篩選得到高產突變株，其脂肪酸產量達到1．2g／L。

1．4 其他誘變方法育種

磁場生物學效應是生物磁學領域的一個研究熱點。磁場作用于生物體的最直接效應可能是影響膜內電場變化、細胞膜及跨膜信息傳遞活性、細胞酶活、自由基基團等，進而引起生物大分子 （如DNA）造成損傷，使生物產生基因的損傷和突變等效應，從而間接影響基因的轉錄與表達［26］。盡管電磁場對微生物基因表達的作用機制目前尚不清楚，但國內外已有大量關于磁場作用于微生物菌株的研究。高夢祥等［27］利用磁場處理啤酒酵母，發現磁場強度0．563A／m和0．669A／m作用時間2h時，磁場對啤酒酵母促進作用最強，其菌液濃度增長了34．01%。磁場處理猴頭菌，發現磁場強度為0．8A／m，作用時間為24h時，胞外多糖的生長促進作用最強，猴頭菌胞外多糖質量濃度增長率達187．5%［28］。Ozden等［29］研究極低頻磁場對粘紅酵母產轉化酶產量的影響，結果表明，7m T磁場處理組的生物量較對照組增加了14%～28%，處理組較對照組轉化酶產量增加了48%～67%。基于磁場對微生物菌株生長和代謝產量的促進作用，使得磁場可以作為微生物菌種誘變研究中的有效手段。在微生物育種中也用到其他誘變技術，如空間、激光、微波等誘變方法。

2 篩選方法

篩選得到目標微生物菌種是微生物育種的最終目的。通過各種誘變手段改變菌體的遺傳性狀后，如何從數量龐大的菌體族群中篩選特異性目標菌種，是育種上最關鍵也最耗時費力的工作，篩選在一定程度上是決定菌種選育效率的關鍵步驟［16］。

2．1 抗性篩選法

微生物的某些抗生素抗性突變會直接影響其產物的代謝調控系統［30－31］，從而改變突變株代謝產物的產量，因此抗性篩選法可用于有用產物生產菌優良菌株的選育和改良。抗生素抗性篩選是基于微生物對抗生素產生耐藥性發展起來的菌株選育技術，因其實驗操作簡便、效果顯著而在有用微生物菌株選育中得到廣泛應用［32］。而篩選方法一般包括單一抗性篩選如鏈霉素抗性篩選，多種抗生素的多重抗性篩選，以及與其他誘變技術相結合的抗性篩選。

張智翔等［33］以玫瑰孢鏈霉菌 （Streptomyces roseosporus）ATCC 11379為出發菌株，通過在不同濃度梯度的達托霉素和鏈霉素復合抗性平板上進行抗性篩選，結果篩選到一株高產達托霉素的突變株D1000－S3－2，經搖瓶發酵驗證達托霉素發酵單位可達59mg／L，比出發菌株提高了63．8%。劉垚等［34］以經紫外線誘變處理過的博來霉素產生菌為對象，應用鏈霉素抗性篩選法獲得了151株鏈霉素抗性突變株，并獲得一株產抗生素能力為出發菌株約1．25倍的突變株。阿維菌素高產菌株Y0910－67的篩選就是以Y0909－12為原始菌株，經過亞硝基胍誘變后，采用鏈霉素進行抗性篩選得到的，其效價較對照高出16．9%［35］。

2．2 熒光篩選法

熒光標記技術是一種非放射性的標記技術，是指利用一些能發熒光的物質共價結合或物理吸附在所要研究分子的某個基團上，利用它的熒光特性來提供被研究對象的信息［36］。近年來，熒光標記技術取得了迅速的發展，廣泛應用于原生質體融合子的篩選、微生物菌株篩選、細胞內外物質檢測等方面，在微生物學研究領域里發揮了很大的作用。

熒光染色標記是一種非人工遺傳標記，其可用于標記原生質體來篩選融合子菌株。在制備原生質體時，使雙親株原生質體帶上不同的熒光色素，原生質體融合后，直接篩選出帶有兩色熒光的融合子即可。龍建友等［37］在鏈霉素No．24菌株及其誘變株Ms－24菌株的原生質體懸浮液中分別加入酚藏花紅和伊文思藍2種熒光色素進行標記，將帶有紅、藍熒光色素的親本原生質體融合，然后在熒光顯微鏡下直接篩選同時帶有紅藍熒光的融合子。利用熒光染料進行標記分析，操作簡便、高穩定性、高靈敏度、高選擇性，而且還可以大大縮短融合的工序和時間，提高篩選融合子的效率，是一種快捷、高效的的篩選方法，現已被眾多研究者廣泛使用。

熒光素酶是生物組織體內由于代謝活動催化熒光素或脂肪醛氧化發光的一類酶的總稱，其可用于標記基因、細胞和活體動物。標記方法是通過分子生物學克隆技術，將熒光素酶基因插到預期分析的細胞染色體內，通過單克隆細胞技術的篩選，培養出能穩定表達熒光素酶的細胞株［38］。Vesterlund等［39］利用細菌的熒光素酶基因克隆到金黃色葡萄球菌，大腸桿菌和沙門氏菌等指示菌中，使得指示菌具有熒光酶基因lux AB和負責合成長鏈脂肪醛的luxCDE基因，用于產生熒光，可以快速檢測并篩選出具有抗菌作用的菌株，且該方法已經用于快速篩選具有抗菌活性的乳酸菌［40］。該方法具有快速、準確等優點，可以在1～2h內得到結果，是一種快捷、高效的的篩選方法。

2．3 基于PCR的快速篩選法

PCR即聚合酶鏈式反應 （Polymerase Chain Reaction，PCR），是美國PE－Cetus公司的科學家Kary Banks Mulis于1985年發明的一種可在體外快速擴增特定基因或DNA序列，并在短時間內可獲得大量特異DNA序列拷貝的新技術。由于PCR技術可快速特異地擴增任何期望的DNA片段或目的基因且操作簡便、特異性和靈敏度高、結果可靠，所以其自1985年問世以來至今得到了迅速發展，該技術已廣泛用于微生物學、分子生物學、生物工程和生物分類學等領域中。隨著現代分子生物技術、基因組測序和生物信息學等的快速發展與廣泛應用，使得基于PCR方法的快速篩選可以作為微生物菌種篩選研究中的有效手段，可以快速篩選出所需的目標菌種。

隨著不同乳酸菌菌株基因組測序的完成及乳酸菌代謝產物編碼基因等生物信息的豐富，Michat等［41］根據已知的class IIa型細菌素的編碼基因，設計了編碼class IIa細菌素基因的7對保守的PCR引物，利用PCR方法從40種奶酪樣品中篩選出了產class IIa細菌素的乳酸菌。張紅發等［42］在基因序列數據庫中查找益生雙歧桿菌的16Sr DNA共有序列，找出它們共有的特異性序列，設計了PCR引物，平板培養分離，初步篩選雙歧桿菌菌落。根據細菌16Sr DNA和23S r DNA兩側高度保守區域設計通用引物，提取菌落基因組DNA，擴增16S－23Sr DNA間區序列，并送測序。通過3輪PCR及序列同源性比對分析鑒定，從人體定向篩選到長雙歧桿菌。傳統篩種方法具有隨機性、盲目性，而PCR篩菌增加了目的性和效率，給篩菌工作帶來了很大的便利。

雖然PCR技術的篩選方法具有靈敏、快速、簡單等優點，但是在實際操作過程中所利用的特異性引物的特異性上很難把控，需要在其特異性靶點上下功夫，才能保證較高的擴增產物濃度。

3 結語

微生物育種中的誘變和篩選環節極為繁雜，尤其是篩選工作量很大，尋找快速、有效的高通量篩選平臺至關重要。在微生物菌種選育生產實踐中可根據不同菌種的特點及生產需求，選擇不同的誘變技術和篩選方法。隨著遺傳學和分子生物學領域的飛速發展，基因組學、蛋白質組學及生物信息學的應用日益廣泛，相信許多新型高效的技術將被應用于菌種誘變篩選，創造出更多有利于發酵工業生產的微生物新品種，大大推動工業微生物菌種改良篩選技術的發展，為微生物工業帶來新的希望。

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