大腸桿菌溯源技術研究進展

趙宏，趙化冰，曲鵬，李宗夢，李君文

（1.天津出入境檢驗檢疫局，天津 300461；2.中國人民武裝警察部隊后勤學院，天津市職業與環境危害防制重點實驗室，天津 300162；3.中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學與環境醫學研究所，天津 300050）

大腸桿菌是人和溫血動物腸道中的正常棲居菌。通常情況下，大腸桿菌對人類是無致病性的。但是某些情況下，大腸桿菌中的致病性菌株侵入人體一些部位時，就會對人類健康產生嚴重威脅。

近些年由致病性大腸桿菌導致的全球食品污染事件頻發，從人們熟知的、肆虐全球20 年的大腸桿菌O157 ∶H7 以及去年于德國爆發的大腸桿菌O104 ∶H4均對人類健康以及經濟貿易造成了重大損失。盡管人們已經研發出了多種針對致病性大腸桿菌某些血清型的快速、靈敏的檢測技術，使得目標菌在較短時間內被準確檢出。但是在致病微生物的溯源領域仍然缺乏有效技術。剛剛過去的德國大腸桿菌疫情讓世界認識到了有效的追溯體系對于避免大腸桿菌疫情再次上演至關重要。因此建立有效的微生物追溯方法、簡便高效的追溯技術將改變公共衛生突發事件的處置模式，極大提高工作效率。

因此，國內外的科研工作者試圖用各種技術來實現包括致病性大腸桿菌在內細菌溯源問題，取得了一定的進展。本文對于細菌溯源技術及在大腸桿菌研究中的進展進行了介紹。

“微生物溯源”一詞最先由Hagedorn 和Wiggins 提出。微生物溯源是指通過比較污染樣品和可能污染源中的微生物的差異或其他生物標記的有無來判斷兩者之間的聯系，進而確定污染來源[1-3]。

目前，人們對于檢測比較污染樣品和可能污染源中的微生物差異的方法主要可以分為兩類：生物化學方法（即表型方法）和分子方法。

生物化學方法（即表型方法）是以微生物基因產物——各種酶的生化反應為基礎，來判定微生物種類。常用的生物化學方法包括抗生素耐藥性分析法（antibiotic resistance analysis）和碳源利用法（carbon source utilization）。這兩種方法在實際檢測時都需要對大腸桿菌進行選擇性培養并建立數據庫才能完成細菌源的追蹤分析。分子方法是基于細菌的遺傳物質即DNA 為研究對象的。通過建立細菌個體的“DNA 指紋”，將分離于污染物的細菌樣本與可能的污染來源分離得到同類細菌樣本DNA 指紋進行比對分析，從而得到污染來源。生化方法花費低，操作簡單，不依賴于大型分析儀器、適合日常大批量樣本分析的特點使之在基層應用比較普及。但從本質說，生物化學方法是基于細菌表型的鑒定方法，其結果容易因菌體生活狀態及培養條件的改變而產生變化，鑒定結果不夠穩定，這是生化方法的不足；分子方法是基于細菌的遺傳物質的差異，是通過分析菌株特定的基因位點或染色體組的多態性差異鑒定菌株種類，因此更加可靠穩定，更加適合細菌溯源研究。

目前主要的細菌溯源的分子方法主要包括：脈沖場凝膠電泳法（PFGE）、限制性片段長度多態性（RFLP）分析、腸桿菌基因間重復一致序列的聚合酶鏈式反應（ERIC-PCR）、擴增片段長度多態性（AFLP）、單核苷酸多態性（SNP）分析、細菌的核糖體基因分型（ribotyping）、多位點序列分析（MLST）等。

1 脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）

1984 年，Schwartz 和Cantor 首先提出了脈沖電泳法，原理是將經過凝膠的連續電場改為脈沖電場，這就使百萬兆基大小的DNA 片段以特定的大小尺寸進行分離，同時使得片段的分析精確性更高。現已證實PFGE 方法的鑒別能力相當高，在大腸桿菌的研究領域中占有很大優勢。PFGE 現在被廣泛用于致病微生物的分型[4]，被譽為細菌分子生物學分型技術的“金標準”[5]。目前，美國FDA 已經建成了基于PFGE 的致病微生物檢測網絡，即PulseNet。美國PulseNet 網絡依托各地州監測實驗室，通過分離的病原細菌DNA“指紋圖譜”分析（主要利用脈沖場凝膠電泳技術）以及網絡化信息交流平臺，發現傳染病的跨地區和國際間傳播，開展傳染病暴發流行的調查、追蹤、溯源，已經成功發現、處置和預警了多起食源性傳染病暴發疫情。目前國際PulseNet 已經拓展到眾多區域，組成了包括加拿大PulseNet、歐洲PulseNet、亞太區PulseNet、拉丁美洲PulseNet、中亞PulseNet 在內的國際化網絡。該網絡也已經成為世界衛生組織以及國際公共衛生機構獲取信息和應對公共衛生事件的重要依據。國際PulseNet 涉及的傳染病病原體包括產毒性大腸桿菌O157、沙門菌、單增李斯特菌、志賀菌、彎曲桿菌、霍亂弧菌等。

理論上，所有的細菌都能通過PFGE 進行分型分類。PFGE 在細菌溯源研究中的應用是基于菌株的DNA 指紋原理來確定菌株之間的親緣關系。在食源性病原體溯源研究中，對分離出的菌株進行脈沖場凝膠電泳處理，依據Tenover 等（1995）[6]提出的有關菌株同源性判別標準判斷菌株之間的相關性，對協助追蹤感染來源起到了重要作用。Bono JL，Smith TP 等對于STEC O157 的來源進行研究，利用PFGE 對426 個分離株進行分析，結果揭示了STEC O157 存在762 個基因組多態性，可分成175 個型。該研究發現在8 個主要STEC O157 譜系中，有7 個來源于牛，揭示了PFGE 對于流病菌株內部親近菌株的進化關系分析具有優勢[7]。

2 限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）

RFLP 是最早被使用的分子標記技術，它反映了DNA 分子不同酶切位點的分布情況。其原理是DNA序列堿基的改變能夠引起限制性內切酶位點的產生或消失，限制性內切酶對不同個體的DNA 序列處理后所產生的片段長度不同，通過凝膠電泳區分出不同的條帶，與DNA 探針進行Southern 雜交和放射自顯影后便可獲得能反映出個體特性的RFLP 圖譜。RFLP 標記不受標記位點數目的限制，共顯性好，結果很穩定，適合用于構建遺傳連鎖圖譜。Ho PL，Lo WU 等利用對大腸桿菌中CTX-M 編碼質粒進行包括RFLP 在內的分析，以鑒定分離株是來源于動物糞便、人糞或人尿中，研究表明在IncFII group 的大腸桿菌菌株的CTX-M-14 編碼質粒具有不同的來源[8]。

3 腸桿菌基因間重復一致序列的聚合酶鏈式反應（enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction，ERIC-PCR）

ERIC（enterobacterial repetitive intergenic consensus）是Sharples 等首先在大腸桿菌中發現的一種腸桿菌基因間共有重復序列[9]。其中心存在高度保守的、長約44 bp 的核心序列。不同種屬個體間表現為在染色體上存在的位置和拷貝數不同，可進行指紋圖譜分析。原理是利用根據ERIC 核心序列設計的反向引物進行PCR 擴增，擴增產物大小在50 bp～3 000 bp 之間，根據所得數目不等、大小不同的各自獨特的電泳帶型來達到菌株分型的目的。ERIC-PCR 技術不僅可以用于含ERIC 序列的細菌的分類與鑒定還可進行菌株親緣關系鑒定等研究[10-15]。DuanH，ChaiT 等利用ERIC-PCR 對于豬舍氣溶膠中的大腸桿菌來源進行分析。他分別對豬舍舍內、上風處及下風處等6 個點進行菌株收集。實驗證明35.1%的氣溶膠大腸桿菌來源于豬的糞便[16]。

4 擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphisms，AFLP）

AFLP 是由1992 年荷蘭科學家Zabeau 和Vos 所創造[17]，其原理是將RFLP 和RAPD 相結合，用內切酶切割基因組DNA 獲得不同長度的片段，用特定的接頭使這些DNA 片段的兩端連接，形成一個帶接頭的特異片段，通過接頭序列和PCR 引物3′末端的識別進行PCR 擴增，最后通過聚丙烯酰胺電泳使這些特異的限制性片段分離。AFLP 結合了RFLP 和RAPD 兩種技術的優點，使標記方法既具有RFLP 的可靠性，又具有RAPD 的靈敏性。此方法操作簡單、成本較低、省去了制備探針和分子雜交的過程、多態信息含量豐富，是目前一種有效的分子標記。AFLP 是第一代分子標記，在基因定位、連鎖圖譜的構建等方面應用較多。目前AFLP 在大腸桿菌來源追溯上的應用研究較少，查到的有Leung KT，Mackereth R 等利用AFLP 技術對110株不同寄主來源的大腸桿菌分離株進行溯源與致病力的研究，發現AFLP 在檢測大腸桿菌寄主來源及致病性方面具有很高效率。對寄主識別率在90%以上，對于非致病大腸桿菌與腸致病性，VT 細胞毒素型的區分率也在90%以上[18]。Guan S，Xu R，Chen S 等也利用AFLP 對105 株不同來源的寄主糞便中分離得到的大腸桿菌進行來源追溯，發現94%牲畜分離株，97%野生動物分離株，97% 人分離株被準確追溯，AFLP 與multiple-antibiotic-resistance（MAR）和16SrRNA 相比，具有更高效率[19]。

5 單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP）

SNP 是第三代分子標記技術，它是指基因組上的單個核苷酸發生變異而引起的多態性，SNP 所表現的多態性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉換（transition）或顛換（transversion）所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP 并不包括后兩種情況。轉換和顛換的比例大概為2 ∶1。SNP是二等位基因多態，也叫做雙等位基因標記（biallelic marker），有時也會有3 個和4 個等位基因多態性存在，但這很罕見。由于二等位多態性是非此即彼的選擇，往往只分析＋/－即可，有利于進行基因分型和自動化篩選[20]。SNP 分布十分廣泛，幾乎在所有的已知或未知基因附近都能找到一系列的標記位點[21-22]，在人體中，每一千個堿基當中就會發生一個SNP[23]，而在其他的哺乳類動物的基因組中也很可能含有兩到三百萬個SNP。早期研究證實，在獲得更加豐富的SNPs 基礎上可以大大增加對大腸桿菌進行分型的能力。因此大腸桿菌SNPs 位點研究逐漸成為熱點。2005 年，Florence Hommais 利用MLST 技術研究大腸桿菌SNP位點以及基于SNPs 的進化關系[24]。2006 年，張唯等利用STEC O157：H7 全基因組測序芯片篩查獲得了可觀的SNPs，在523 染色體組基因中共發現906 個不同的SNPs。由此并制作了STEC O157：H7 染色體SNP 結構圖，進而以此對STEC O157：H7 的起源做了研究[25]。

因此SNP 所獨有的數量多、分布廣泛、適于快速、規模化篩查、易于基因分型的特性決定了它更適合于對細菌不同地域性進行溯源識別，在食品安全相關的細菌溯源研究具有巨大潛力。本課題組對多個國家進口的食品中大腸桿菌分離株進行了基于持家基因SNP研究，發現了適于溯源的特異性地理標記，顯示了SNP技術具備地理溯源能力。

6 細菌的核糖體基因分型（ribotyping）

核糖體分型技術是RFLP-Southern 印記技術的一種，所使用的探針是根據16S 和23SrRNA 序列設計，大大減少了雜交后圖譜所包含條帶的數量，非常易于分析。但是這一特點也限制了這一技術應用于相關性較近的菌株間的鑒別。

核糖體分型利用細菌核糖體RNA 都含有高度保守的“持家基因”特性，核糖體RNA 基因存在于所有細菌中并且在遺傳上高度保守，所有細菌在染色體不同位點上都有多個核糖體基因操縱子，針對該保守序列設計探針，與之雜交，可以觀察核糖體RNA 基因在整個基因組分布的多態性。具體方法是將基因組DNA 進行酶切消化并用電泳進行分離，然后采用針對核糖體持家基因設計的特異性探針進行雜交，記錄探針的雜交狀況，從而得到核糖體RNA 基因分布圖。美國Dupont 公司全自動微生物核糖體基因分型系統（RiboPrinter microbial characterization system）的推出，使得RT 分型方法實現了自動化和標準化，這是其在分子分型中應用的優勢。利用這套系統對細菌進行核糖體分型，可在8 h 內獲得結果，該方法可在短時間內對大量致病菌進行分析，結果重復性較高。Wu J，Rees P，Dorner S.對于Blackstone River 分水嶺上部的大腸桿菌的密度以及來源通過ribotyping 進行研究。對于大腸桿菌來源的研究結果分析，利用ribotyping 可以確定在居住區大部分大腸桿菌來源于人，而在開闊地和叢林則主要來源于野生動物[26]。

7 多位點序列分析（Multilocussequencetyping，MLST）

多位點測序分型（MLST）技術是近些年才發展起來的分子生物學分析方法，它結合了高通量的序列測定和生物信息學的方法，具有較高的分辨率。它針對持家基因設計引物進行PCR 擴增和測序，根據得出的每株病原體各個座位等位基因數目進行等位基因圖譜或序列類型鑒定以及聚類分析。該技術快速簡便，重復性好，分辨率較高，數據標準，可實現實驗室間數據共享及比較[27]。該技術被用于許多致病微生物的進化研究。Andrew R.Dodgson 等應用MIST 方法對不同地理區域收集的107 株臨床光滑念珠菌菌株及2 個參考菌株進行指紋圖譜分析，對11 個持家基因編碼區進行擴增并測序分析，其中有6 個基因的擴增片段具有多態性位點，81 個核苷酸位點發現有變異。在109 株菌中鑒定出了30 個序列型（STs），在所有分離株中有5 個主要的分支，其中3 個進化分支顯示明顯的地理差異，表明在不同的地理區域，光滑念珠菌具有明顯的遺傳分化[28]。

Maxim S.Sheludchenko，Flavia Huygens 通過MLST數據庫分析，運用生物信息學分析軟件根據大腸桿菌MLST 數據庫數據為基礎，確定以大腸桿菌6 個管家基因中的8 個高分辨率的SNP 位點組合為標記，使用等位基因特異性實時熒光PCR 技術（AS-qPCR）對于澳大利亞昆士蘭東南地區環境糞便樣本分離得到的114 株大腸桿菌進行溯源分析。結果將114 株大腸桿菌劃分為50 個不同的SNP profiles，并且還發現了一些寄主特異性的SNP profiles，這其中就包括人源特異的SNP profiles[29]。這在該課題組隨后的研究中利用6個人源SNP profiles 對昆士蘭東南地區Coomera River 進行了為期2 年的研究。證明了人源特有的SNPprofiles 存在，并以此做了人為活動對水源的影響研究[30]。但該技術在管家基因不存在或僅存在低水平變異的病原株中分辨率較低，而且系統進化樹圖不一定能反映其間的系統發生關系。

綜上所述，在大腸桿菌溯源研究中多種分子生物學技術和方法都被嘗試應用。這些技術各有優劣，運用得當會在食品安全監管、公共衛生、疾病預防以及口岸健康監控、食品安全等領域發揮應有作用。上述技術也許還不能完全概括現今研究的全部，但是筆者認為這些技術可能在未來的細菌溯源研究領域中繼續使用，尤其是在致病性大腸桿菌追溯體系中占有一席之地，只是所占比例有所不同。在這些技術中，SNP及MLST 技術將是未來主要方向。受到人類基因組計劃的推動，人類對于大腸桿菌基因組結構及功能已經清晰掌握，并可能運用強大的生物信息學手段找到適合各種溯源要求的標記。SNP 的另一個迷人之處在于它的檢測易于自動化、高通量，所以一旦發現可用于溯源的標記，大腸桿菌的溯源就變得簡單易行了。同時，SNP 技術結合了MLST 的開放數據平臺，借助eBURST 分析可以為研究大腸桿菌群體遺傳關系，分析大腸桿菌地域間遺傳多樣性提供強大支持。因此，我們相信日新月異的分子生物學技術必然會促進大腸桿菌溯源技術的不斷進步，使大腸桿菌的行蹤在人類掌握之下，從而使人類能更好地預防因致病性大腸桿菌導致的食源性疾病。

[1]Meays CL,Broersma K,Nordin R,et al.Source tracking fecal bacteria in water：A critical review of current methods[J].Journal of environmental management,2004,73(1)：71-79

[2]Scott T M,Rose J B,Jenkins T M,et al.Microbial source tracking：Current methodology and future directions[J].Applied and environmental microbiology,2002,68(12)：5796-5803

[3]Carson C A,Shear B L,Ellersieck M R,et al.Comparison of ribotyping and repetitive extragenic palindromic PCR for identification of fecal Escherichia coli from humans and animals[J].Applied and environmental microbiology,2003,69(3)：1836-1839

[4]Myoda S P,Carson C A,Fuhrmann J J,et al.Comparison of genotypic based microbial source tracking methods requiring a host origin database[J].Journal of water and health,2003,1(4)：167-180

[5]邱少富,端青.類鼻疽伯克霍爾德菌基因分型技術研究進展[J].軍事醫學科學院院刊,2009,33(2)：176-178

[6]Tenover F C,Arbeit R D,Goering R C,et al.Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed field gel electrophoresis：criteria for bacterial strains typing[J].J Clin Microbiol,1995,33(9)：2233-2239

[7]Bono J L,Smith T P,Keen J E,et al .Phylogeny of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli O157 isolated from cattle and clinically Ill Humans[J].Mol Biol Evol,2012,29(8)：2047-2062

[8]Ho PL,Lo WU,Yeung MK,et al.Dissemination of pHK01-like incompatibility group IncFII plasmids encoding CTX-M-14 in Escherichia coli from human and animal sources[J].Vet Microbiol,2012,158(1/2)：172-179

[9]SHARPLES G J,LOYD R G.A novel repeated DNA sequence located in the intergenic regions of bacterial chromosomes[J].Nucleic acids research,1990,18(22)：6503-6508

[10]林朝紅,倪學勤,曾東,等.重復序列ERIC(IRU)研究進展[J].微生物學報,2007,47(2)：370-373

[11]VERSALOVIC J,KOEUTH T,LUPSKI J R.Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacteria genomes[J].Nucleic acids research,1991,19(24)：6823-6831

[12]劉佳妍,金莉莉,王秋雨.細菌基因組重復序列PCR 技術及其應用[J].微生物學雜志,2006,26(3)：90-93

[13]JurkovicˇD,Krizˇková L,Sojka M,et al.Genetic diversity of Enterococcus faecium isolated from Bryndza cheese[J].Int J Food Microbiol,2007,116(1)：82-87

[14]Hulton C S,Higgins C F,Sharp P M.ERIC sequences：a novel family of repetitive elements in the genomes of Escherichia coli,Salmonella typhimuirum and other enterobacteria[J].Mol Microbiol,1991,5(4)：825-834

[15]McCartney A L,Wenzhi W,Tanock G W.Molecular analysis of the composition of the bifidobacterial and lactobacillus microflora of humans[J].Appl environ microbiol,1996,62(12)：4608-4613

[16]Duan H,Chai T,Liu J,et al.Source identification of airborne Escherichia coli of swine house surroundings using ERIC-PCR and REP-PCR[J].Environ Res,2009,109(5)：511-517

[17]Velappam N,Sondgrass J L,Hakovirta J R.Rapid identification of pathogenic bacteria by single-enzyme amplified fragmem length polymorplfism analysis[J].Diagnostic microbiology and infections disease,2001,39(2)：77-83

[18]Leung K T,Mackereth R,Tien Y C,et al.A comparison of AFLP and ERIC-PCR analyses for discriminating Escherichia coli from cattle,pig and human sources[J].FEMS Microbiol Ecol,2004,47(1)：111-119

[19]Guan S,Xu R,Chen S,et al.Development of a procedure for discriminating among Escherichia coli isolates from animal and human sources[J].Appl Environ Microbiol,2002,68(6)：2690-2698

[20]吳昕彥,張慶華,陳竺.單核苷酸多態性研究及應用[J].中華醫學遺傳學雜志,2000,17(1)：57-59

[21]王淑新,連林生.單核苷酸多態性作為新一代分子標記的優越性[J].中國畜牧獸醫,2008,35(4)：31-33

[22]Sachidanandam R,Weissman D,Schmidt S C,et al.The International SNP Map Working Group.A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms[J].Nature,2001,409(6822)：928-933

[23]COOPER D N,SMITH B A,COOKE H J.An estimate of unique DNA sequence heterozygosity in the human genome[J].Human genetics,1985,69(3)：201-205

[24]Hommais F,Pereira S,Acquaviva C,et al.Single-nucleotide polymorphism phylotyping of Escherichia coli[J].Appl Environ Microbiol,2005,71(8)：4784-4792

[25]Zhang Wei,Qi Weihong,Thomas J Albert.Probing genomic diversity and evolution of Escherichia coli O157 by single nucleotide polymorphisms[J].Genome Res,2006,16(6)：757-767

[26]Wu J,Rees P,Dorner S.Variability of E.coli density and sources in an urban watershed[J].J Water Health,2011,9(1)：94-106

[27]Maiden MCJ.Multilocus sequence typing：a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(6)：3140-3145

[28]Andrew R Dodgson,Claude Pujol.Multilocus sequence typing of Candida glabrata reveals geographically enriched clades[J].J Clin Microbiol,2003,41(12)：5709-5717

[29]Sheludchenko MS,Huygens F,Hargreaves MH.Highly discriminatory single-nucleotide polymorphism interrogation of Escherichia coli by use of allele-specific real-time PCR and eBURST analysis[J].Appl environ microbiol,2010,76(13)：4337-4345

[30]Sheludchenko MS,Huygens F,Hargreaves MH.Human-specific E.coli single nucleotide polymorphism (SNP)genotypes detected in a South East Queensland waterway[J].Australia：Environ Sci Technol,2011,45(24)：10331-10336