乳腺癌循環(huán)腫瘤細胞臨床應(yīng)用的研究進展

李陽 劉巍

循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)起源于原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移灶，存在于腫瘤患者外周血中，雖然其在外周血中所占比例很小［1］。研究發(fā)現(xiàn)檢測CTCs不僅能反映腫瘤負荷，還能預(yù)測復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險，多種腫瘤中CTCs陽性者生存率明顯低于陰性者，在治療期間定期檢測并監(jiān)測CTCs的變化，可為評價治療方案的敏感性提供依據(jù)，并且可以作為靶向治療的靶標，有利于開展個體化的治療［1］。越來越多的醫(yī)學(xué)工作者開始關(guān)注CTCs，本文就相關(guān)研究進行綜述。

1 CTCs

1869年，Ashworth在1例癌癥死亡患者的外周血中發(fā)現(xiàn)了相似腫瘤的細胞，并提出了CTCs的概念［2］。目前的腫瘤轉(zhuǎn)移理論認為，隨著腫瘤細胞不斷增殖，部分腫瘤細胞失去相互黏附的能力，從腫瘤母體脫離，浸潤周圍組織，甚至進入到血液或淋巴系統(tǒng)中。腫瘤細胞脫落、侵襲并進入血液循環(huán)是腫瘤轉(zhuǎn)移的最初階段，并為形成腫瘤轉(zhuǎn)移病灶提供了可能，因此在外周血中檢測循CTCs具有重要的臨床應(yīng)用價值。CTCs的檢測有助于早期轉(zhuǎn)移腫瘤患者的診斷、監(jiān)測術(shù)后患者腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移、評估抗腫瘤藥物敏感性、患者預(yù)后［3］以及選擇個體化的治療策略。

2 CTCs檢測方法

CTCs在外周血中所占比例很小［4］。現(xiàn)有針對 CTCs的檢測技術(shù)主要包括細胞富集和鑒定兩個階段。細胞富集主要用物理、化學(xué)原理，細胞鑒定主要依靠腫瘤細胞存在的腫瘤特異性或器官特異性標記以及腫瘤細胞本身的形態(tài)學(xué)特征等。選擇兩個階段的不同方法并加以有效結(jié)合，最終尋找出敏感度和特異性較高的簡便、精確的方法。

2.1 細胞篩選/富集技術(shù) 富集方法通常是CTCs物理性質(zhì)(密度和大小)或免疫磁性的分選，常用的細胞富集技術(shù)主要包括密度梯度離心法、過濾法、免疫磁性分選技術(shù)(Immunomagnetic Separation，IMS)。因ISM利用免疫磁珠結(jié)合活性蛋白質(zhì)和被磁鐵所吸引的特性，依靠被分離細胞上抗原與包被磁珠的抗體的特異性反應(yīng)形成抗原—抗體、磁珠免疫復(fù)合物。借助外加磁場完成對CTCs的篩選/富集。這類技術(shù)最大的優(yōu)勢在于分選過程避免了細胞裂解，但需借助細胞表面特異性標記物作為篩選的靶標，所以靶標的表達狀況會影響分析方法的敏感性和特異性，且缺乏標準步驟及反應(yīng)試劑等［5］。

2.2 腫瘤細胞鑒定技術(shù) 常用的鑒定檢測技術(shù)包括逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、免疫細胞化學(xué)技術(shù)(Immunocytochemistry，ICC)、熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH)和流式細胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)等。RT-PCR是目前檢測CTCs比較有效的方法，具有高效、高敏感、高特異性等優(yōu)點。但由于測定過程需破壞 CTCs，因此無法對細胞進行形態(tài)學(xué)觀察。ICC的基本機制是抗原抗體反應(yīng)，利用單克隆抗體和特異性腫瘤標志物相結(jié)合，通過酶與底物反應(yīng)顯色判斷腫瘤細胞的是否存在，對腫瘤細胞進行定量、定性、定位分析。其優(yōu)點是簡便，直觀，缺點是因為腫瘤細胞表面抗原表達不均一，影響了檢測的敏感度，亦可能出現(xiàn)假陽性率。FCM是以流式細胞儀作為工具，對懸液中的細胞進行測量和分析其優(yōu)點是快速、定量，卻不能提供細胞形態(tài)等方面的信息，尚不能很好的區(qū)別腫瘤細胞和正常細胞。鑒于以上方法尚不能單獨提供足夠的高特異性，因此為增加CTCs檢測方法的特異性及敏感性，Gilbey等［6］認為多聯(lián)合應(yīng)用不同檢測方法是非常有必要的。

2.3 微流控分析芯片技術(shù) 隨著微流控和微機械加工技術(shù)(MEMS)的不斷完善和發(fā)展，微流控芯片技術(shù)在細胞水平上的生物學(xué)研究和臨床實驗診斷等領(lǐng)域里的優(yōu)勢日趨顯著。微流控芯片又稱芯片實驗室(Lab-on-a-Chip)，是將生物和化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成或基本集成在一塊芯片上，由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，可控流體貫穿整個系統(tǒng)。雖然微流控芯片技術(shù)進行 CTCs檢測還在起步階段，但此技術(shù)的出現(xiàn)卻為CTCs檢測技術(shù)的發(fā)展提供了新的方法和思路。

3 CTCs檢測乳腺癌的臨床應(yīng)用

世界范圍內(nèi)乳腺癌已經(jīng)成為女性最常見的惡性腫瘤［7］。在我國尤其是大城市里，乳腺癌的發(fā)病率也逐漸上升，其中復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者主要的致死因素。血行播散是乳腺癌轉(zhuǎn)移的重要途徑，腫瘤細胞進入外周血是腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的前提，因此乳腺癌是最早用來研究CTCs的，研究發(fā)現(xiàn)CTCs不僅存在于轉(zhuǎn)移的患者中，在非轉(zhuǎn)移的患者的循環(huán)系統(tǒng)中同樣存在［8］，也是當前研究的較成熟的腫瘤。乳腺癌CTCs檢測在診斷、治療、評估療效及提示預(yù)后等多方面具有重要的臨床意義。

3.1 乳腺癌診斷 CTCs檢測外周血標本較易采集，故對部分病理類型及腫瘤基因型和表型特征不明的患者可利用對CTCs的檢測來協(xié)助診斷。血循環(huán)中檢測到CTCs并不意味著有轉(zhuǎn)移，但遠處轉(zhuǎn)移的概率會明顯增加。Reinholz等［9］研究用CTCs的分子生物學(xué)特征來早期診斷乳腺癌。無腫瘤病史，乳腺鉬鈀片發(fā)現(xiàn)乳腺異常而準備行活檢術(shù)的患者，用密度梯度離心法和免疫磁性分離法聯(lián)合實時定量RT-PCR用于定量四種乳腺特異性基因：乳腺珠蛋白、GABA A(pi)、B305D-C和B726P的表達水平，發(fā)現(xiàn)乳腺珠蛋白或B305D-C大于診斷標準的敏感度和特異性分別達到70.5%和81.0%。認為用CTCs的分子生物學(xué)特征對乳腺浸潤性癌的早期診斷有潛在價值。Camara等［10］檢測手術(shù)前及術(shù)后30 min、60 min、3 d和7 d外周血中CTCs的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTCs在術(shù)后30 min、60 min沒有變化，在術(shù)后3～4 d85%的患者升至原來的1 000倍。隨后CTCs出現(xiàn)下降，但58%的患者下降至手術(shù)前水平以上，直至開始術(shù)后輔助化療，在未予進一步治療或僅給予內(nèi)分泌治療的低危患者中，持續(xù)3年監(jiān)測CTCs水平發(fā)現(xiàn)數(shù)量多、持續(xù)升高或僅有輕度下降，提示該部分患者CTCs可能長期存在，這些CTCs可能持續(xù)處于休眠狀態(tài)，但可能在適宜條件下聚集并發(fā)展成為轉(zhuǎn)移灶。

3.2 用于化療療效及預(yù)后預(yù)測的意義 CTCs檢測的意義一般包括對新輔助化療、輔助化療的療效評估及長期的隨訪監(jiān)測。在一項研究中用CellSearch方法對118例新輔助治療的乳腺癌患者進行CTCs檢測發(fā)現(xiàn)，23%的患者在化療前已經(jīng)存在≥1個/7～5 ml外周血，在化療后此比例降到17%;提示CTCs可作為評價新輔助治療療效的早期指標并且是代表PFS的一個預(yù)后因子，該方法已獲 FDA批準用于臨床［11］。Xenidis等［12］用RT-PCR方法檢測437例乳腺癌患者輔助化療前后CK-19mRNA表達。化療前檢測到CK-19mRNA的陽性細胞者與三個以上腋窩淋巴結(jié)陽性相關(guān)，輔助化療后仍為陽性的患者其復(fù)發(fā)和疾病死亡顯著增高，而無病生存和總生存顯著降低，因此認為檢測到CK-19mRNA陽性CTCs是無病生存和總生存下降的一個獨立預(yù)測因子。Ignatiadis等［13］在術(shù)后輔助治療前檢測444例臨床Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌患者的CTCs，總陽性率為40.8%，通過中位時間為53.5個月的隨訪，發(fā)現(xiàn)CTCs陽性組患者較CTCs陰性組患者易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移，DFS顯著縮短。多因素分析提示CTCs是DFS和OS最有價值的獨立預(yù)測因子。Tewes等［14］根據(jù)對32例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者進行治療療效分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在16例治療后CTCs陽性患者中，13例(81%)為疾病進展，僅有3例(19%)達到部分緩解;在16例治療后CTCs陰性患者中，12例(75%)治療有效，4例(25%)疾病進展，總計32例患者中25例的CTCs存在情況與治療效果相關(guān)，提示CTCs可預(yù)測轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的化療療效且預(yù)測率高達78%。另一項探討CTCs與FDG-PET/CT預(yù)后價值研究［15］發(fā)現(xiàn)，在復(fù)發(fā)和進展性乳腺癌患者中，骨轉(zhuǎn)移者出現(xiàn)較高的CTCs，且多發(fā)骨轉(zhuǎn)移較單發(fā)或兩個病灶CTCs數(shù)目要多。在多因素分析中，CTCs是OS的顯著預(yù)測指標。

3.3 乳腺癌CTCs與個體化治療 在CTCs的研究領(lǐng)域，另一個令人感興趣的是內(nèi)分泌和分子靶向治療方案選擇［16］。目前仍主要考慮原發(fā)腫瘤組織的ER、PR和HER-2狀態(tài)，并未考慮CTCs。Xenidis等［17］對119例Ⅰ、Ⅱ期激素受體陽性的乳腺癌患者進行研究，結(jié)果顯示5年他莫昔芬治療期間，在任意時間點檢測到CTCs陽性的患者PFS和OS均遠短于任何時間均未檢測到CTCs的患者，提示CTCs的變化與內(nèi)分泌治療的敏感性及患者預(yù)后密切相關(guān)，輔助化療后體內(nèi)殘存有CTCs的患者，在5年他莫昔芬治療后，循環(huán)血中仍檢測到CTCs的患者比例高達68.2%，提示對化療耐藥的CTCs絕大部分對他莫昔芬也不敏感。Reuben等［18］報道2名原發(fā)腫瘤為ER陽性Her-2陰性但對常規(guī)內(nèi)分泌治療和化療無效的患者，在隨診中發(fā)現(xiàn)多部位轉(zhuǎn)移以及在一線治療前相對數(shù)目較多的CTCs，且CTCs存在Her-2基因轉(zhuǎn)錄。在給予兩周期多西他賽、卡鉑化療并聯(lián)合Trastuzumab治療后，患者癥狀減輕且PET/CT顯示客觀緩解。提示對于難治性乳腺癌，將CTCs的生物標記物作為治療方案選擇的基礎(chǔ)有潛在可能性。

Meng等［19］檢測24例乳腺癌患者CTCs的HER-2基因擴增情況，發(fā)現(xiàn)有9例(37%)患者雖原發(fā)腫瘤不表達HER-2，但是CTCs卻有HER-2的擴增，提示在腫瘤進展過程中CTCs可獲得HER-2擴增。Meng等［19］發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤HER-2表達陰性而CTCs中HER-2表達陽性的患者仍可獲益于Herceptin治療。對9例原發(fā)腫物HER-2表達陰性，CTCs獲得HER-2基因擴增患者中的4例予以Herceptin治療［20］，觀察發(fā)現(xiàn)3例治療有效，其中1例完全緩解、2例部分緩解。此外根據(jù)CTCs是否表達EGFR還可選擇是否應(yīng)用抗EGFR治療［21］，分析乳腺癌患者的CTCs有助于制定更為精確和個體化的治療方案，使更多的患者能接受并受益于內(nèi)分泌及分子靶向治療從而提高生存率。

3.4 乳腺癌 CTCs與腫瘤耐藥性 Gradilone等［22］證實 CTCs多重耐藥相關(guān)蛋白(multidrug-resistance-related proteins，MRPs)與ALDH1表達有統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。但ALDH1陽性與ALDH1陰性兩組患者PFS并差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。提示CTCs中的腫瘤干細胞具多重耐藥特性，這對于腫瘤細胞逃避藥物殺傷，繼續(xù)增殖可能是必要的，但也可能與系統(tǒng)治療后的選擇性有關(guān)［23］。

總之確定乳腺癌CTCs在臨床中是非常有意義的［24，25］，檢測CTCs有助于準確判斷乳腺癌的預(yù)后［26］，并為評判和監(jiān)測化療療效提供依據(jù)，有利于患者的個體化治療，對于乳腺癌的研究前景有很大的潛在應(yīng)用價值。CTCs檢測在未來有望成為乳腺癌患者的臨床常規(guī)檢查。

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