DNA脫堿基位點的檢測與應用

另一方面，由于脫堿基位點產生于正常堿基的缺失脫落，因此在雙鏈DNA雙螺旋結構中形成一個空腔，允許小分子進入其中，空腔的體積對進入的小分子具有一定的空間選擇性。由于空腔位于雙鏈核酸的內部，具有疏水特性。另外，脫堿基位點對面的堿基，由于失去了配對的堿基，重新具備了形成氫鍵的能力。因此，結構合適的小分子，能夠在空腔內通過疏水和氫鍵作用，與核酸分子形成穩定的復合物。脫堿基位點的以上特性，使之被應用于小分子檢測、核苷酸/SNP檢測以及適配體生物傳感器構建等方面的研究工作中。

本文綜合介紹迄今為止檢測DNA脫堿基位點的化學探針檢測方法，歸納總結DNA脫堿基位點在構建小分子檢測元件和生物傳感器等方面的應用，并作以展望。2DNA脫堿基位點的化學探針檢測法

大量脫堿基位點的檢測方法包括32P后標記法、LCMS、ELISA等方法被用于基因中脫堿基位點的檢測。32P后標記法具有靈敏度高、特異性好的優點，但也存在操作復雜且具有放射性的缺欠；LCMS結果準確、可靠，但對待測樣品的前處理要求高，且需要專業人員進行大型儀器操作等。相比之下，ELISA檢測法操作簡單，儀器價格低，但由于所用抗體對結構相似的物質一般有交叉反應，降低了檢測的特異性。20世紀90年代初發展起來的化學探針法某種原因，因為操作步驟簡單、特異性強，且靈敏度合適，成為目前脫堿基位點檢測的主要研究方法之一。

化學探針根據不同作用機理可分屬為共價反應型探針及非共價作用探針兩大類。共價反應探針，是利用化學反應將標記分子與脫堿基位點共價聯接的一類探針。例如脫堿基位點及其氧化衍生物結構中的醛基基團，能夠與氨基基團發生縮合反應，形成穩定的共價結構。基于這個氨醛縮合反應，可合成一端具有氨基基團、另一端為標記基團的共價反應型探針分子，實現脫堿基位點的標記。非共價作用探針，是依靠探針與核酸分子之間的氫鍵、靜電引力、堿基堆積力等弱相互作用力，使探針分子能夠進入脫堿基位點，由此改變探針分子的物理信號（吸光度、熒光、電化學等），從而實現對脫堿基位點識別的探針類型。

基于以上檢測機理，一系列探針可歸結為共價反應型探針。如，對（4硝基芐基）羥胺上的羥胺基團能夠與脫堿基位點核糖殘基的醛基發生縮合反應，將硝基芐基基團共價標記在脫堿基位點上。標記上的對（硝基芐基）羥胺用5′磷酸脫氧核糖4硝基芐基羥胺的單克隆抗體來識別，實現對脫堿基位點的檢測，此方法可以檢測104個堿基對中出現的1個脫堿基位點，或10 fmol/L的脫堿基位點[15]。氨基玫瑰樹堿（9Aminoellipticine， 圖3a）[16]的氨基與脫氧核糖殘基的醛基縮合生成希夫堿，根據希夫堿的熒光信號，實現脫堿基位點的檢測。用14C甲氧胺滴定含有醛基型脫堿基位點的DNA，生成DNA14C甲氧胺復合物，檢測其放射性，實現對脫堿基位點的識別[17]。基于DNA甲氧胺復合物阻斷內切酶及聚合酶的作用，不用具有放射性的甲氧胺，也成功的檢測了脫堿基位點[18]。

目前廣泛用來檢測脫堿基位點的醛基反應探針ARP（Aldehyde reactive probe， 圖3d）[19，20]， 由生物素酰肼與對羧甲基羥胺在碳化二亞胺存在下反應生成對烷基羥胺衍生物，然后將生物素酰肼的聯氨轉換為羥胺而得到。ARP的羥胺與普通脫堿基位點的醛基進行縮合反應，將生物素共價標記在脫堿基位點。標記上的生物素利用生物素/親和素辣根過氧化物酶檢測，可檢測小牛胸腺DNA或噬菌體f1 DNA經過酸加熱處理產生的脫堿基位點，70～100 ng DNA樣品中可檢測出每104個堿基中的1個脫堿基位點。

2.2非共價作用探針

DNA互補堿基對之間形成的氫鍵作用力以及堿基與相鄰堿基間形成的堿基堆積力，是DNA雙螺旋結構穩定的重要因素。堿基脫落后形成的脫堿基位點使局部氫鍵作用力、堿基堆積力失衡，導致DNA局部結構甚至整體結構趨于不穩定，單個堿基缺失能夠降低DNA穩定性3～11 kcal/mol[29]。而小分子進入脫堿基位點形成的空腔后，能夠彌補這些弱相互作用力，從而利于DNA結構趨于穩定。非共價探針進入脫堿基位點空腔，參與分子間氫鍵、范德華力、靜電引力、堿基堆積力等非共價弱相互作用力，導致探針信號發生變化，實現脫堿基位點的檢測[30～32]。

C5呋喃環的嘧啶衍生物（圖4a）是檢測脫堿基位點的一種典型非共價熒光探針。使用C5呋喃環衍生物取代DNA序列中的正常堿基形成C5呋喃環衍生物修飾的DNA序列。此修飾序列與互補DNA序列互不配對形成雙螺旋結構時，C5呋喃環衍生物對面位置為腺嘌呤A時，其熒光信號被淬滅。而當互補堿基脫落成脫堿基位點，其熒光信號相比于對面為腺嘌呤時增強7倍，根據此熒光信號變化可檢測脫堿基位點[33，34]。

Buzzeo等[35]設計合成了具有電化學活性的非共價探針雷德蒙紅（圖4c）。當固定在金電極表面的DNA序列含有脫堿基位點時，雷德蒙紅進入空腔結構，參與堿基堆積作用，產生穩定、可逆的電流信號，明顯高于正常堿基的情況，從而實現了堿基脫落位點的檢測。在另一個工作中，他們合成的金屬銠配合物Rh（bpy）2（chrysi）3+（圖4b） 能夠進入脫堿基位點，并在光催化作用下切斷DNA骨架。基于這一發現，并利用核酸的常規生物學檢測方法，實現了Rh（bpy）2（chrysi）3+金屬嵌入劑對脫堿基位點及單堿基凸起微摩爾級的檢測[36，37]。

核黃素等是一類本身具有熒光的生物小分子，與含有脫堿基位點的雙鏈DNA結合后，熒光信號發生變化。當脫堿基位點對面為胸腺嘧啶且鄰位為鳥嘌呤時，構建的23 nt 雙鏈DNA實現了對核黃素的特異性檢測，核黃素與核酸的結合常數達到5.3×105 L/mol，而對黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）及僅相差1個磷酸根的黃素單核苷酸（FMN）的結合能力分別為0.25×105 L/mol及0.21×105 L/mol，與SELEX技術篩選得到的RNA適配體具有相當的識別能力[40，41]。

對于本身不具備熒光特征的靶分子，可以在雙鏈DNA脫堿基位點的附近引入熒光基團。靶分子進入脫堿基位點空腔后，與相鄰的堿基和熒光基團發生相互作用，改變熒光基團的光學性質。如在脫堿基位點的鄰位引入熒光性堿基類似物2氨基嘌呤（圖5），構建茶堿的識別元件。茶堿進入脫堿基位點后，既與對面的堿基形成氫鍵，又與鄰位2氨基嘌呤發生堿基堆積作用，使其熒光信號下降。這種熒光標記的含脫堿基位點雙鏈DNA識別元件，與茶堿結合的解離常數為10 μmol/L，且在同樣反應條件下對咖啡因（與茶堿僅在N7位相差1個甲基）無響應，與SELEX技術篩選得到的RNA適配體具有相當的識別能力[43]。

利用含有脫堿基位點的DNA構建核酸適配體傳感器的基本思路為：將待測靶分子的核酸適配體經過剪切后延長（圖6 A）、直接延長或設計一段部分互補序列（圖6 B），延長部分或部分互補的DNA序列中含有脫堿基位點[45]。如利用以上方法構建的腺苷適配體傳感器，對腺苷的檢出限為μmol/L級[46]：將腺苷的完整核酸適配體剪切為兩段序列，各自含有腺苷結合位點的部分堿基，在其中一段序列的延長位置引入脫堿基位點。在沒有腺苷分子存在的情況下，兩段序列幾乎不能形成穩定的二級結構，因此脫堿基位點對熒光信號分子幾乎沒有結合能力，熒光信號分子沒有完整的結合位點而游離在溶液中，表現出游離分子的熒光特性。當腺苷分子存在時，腺苷分子與兩段序列中的位點結合，同時使部分互補堿基形成穩定的雙螺旋結構，脫堿基位點在雙螺旋結構內形成疏水空腔，熒光分子進入脫堿基位點而產生熒光信號變化，從而將適配體與腺苷的作用直接轉換成熒光信號改變，能夠檢測1 μmol/L的腺苷。

對腺苷適配體進行直接延長或設計一小段部分互補序列（圖6 B），序列中含有脫堿基位點，使直接延長的部分或者部分互補序列在沒有腺苷存在情況下，與核酸適配體上的某一段序列形成互補配對，互補配對的螺旋結構中脫堿基位點形成空腔結合熒光信號分子，產生初始熒光信號。當溶液中存在腺苷分子時，由于核酸適配體與腺苷分子的結合能力高于核酸適配體與互補單鏈核酸之間的結合能力，互補配對的螺旋結構解旋，含有脫堿基位點的互補序列脫落或游離于結合位之外，脫堿基位點不形成穩定空腔結構，信號分子被釋放到溶液中，產生熒光信號變化，從而將適配體與靶分子的相互作用轉換為熒光信號的變化[47，48]，此傳感器對腺苷檢出限為2 μmol/L。

3.3對SNP的檢測

4發展與展望

堿基脫落是一種常見的DNA損傷，無法修復的脫堿基位點可能會導致DNA轉錄復制的終止或堿基突變、變異，最終會造成機體的癌變、畸變、甚至死亡。脫堿基位點的檢測方法的發展趨勢以操作簡單、快速、實時、安全為目標，同時保證高靈敏度和高特異性。根據不同的脫堿基位點結構，研究人員已經設計合成了相應的共價反應性化學探針，這些探針顯示了非常好的特異性和較高的檢測靈敏度，一般可以檢測出104～105個正常堿基中1個脫堿基位點的存在，是極具潛力的檢測方法。

但是，迄今為止的檢測方法各具不足。非共價作用探針選擇性不強，無法實現腺嘌呤與鳥嘌呤的區分、胞嘧啶與胸腺嘧啶的區分，且檢測靈敏度仍亟待提高。因此合成選擇性強、靈敏的探針是非共價探針的發展方向。共價反應探針是目前使用廣泛的檢測方法之一。其不足在于檢測步驟復雜、耗時，經過沉淀、清洗，且為固相表面檢測。因此發展免清洗的勻相檢測方法，減少操作復雜程度，提高檢測速度，是共價反應探針努力的方向之一。

在應用方面的發展，由于脫堿基位點的尺寸影響，仍舊以小分子檢測為主。另外作為探針的捕獲口袋，可以廣泛的結合其它檢測方法，構建具有內標信號分子的脫堿基位點雙鏈核酸傳感器，相比較而言使用更加方便、應用范圍更廣，可能會得到更快的發展。