超高效液相色譜串聯質譜聯用法快速篩選3—羚基—3—甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑

摘要：建立了超高效液相色譜串聯質譜儀（UPLCMS/MS）檢測酶促反應體系中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）濃度變化，快速篩選3羥基3甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGCR）抑制劑的方法。優化了HMGCR酶促反應體系和檢測NADPH的色譜質譜條件，探討了NADPH的離子化試劑的作用和質譜碎裂機理。采用ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），以三乙胺/六氟異丙醇緩沖液（pH=8.0）為流動相，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，電噴霧離子源多反應監測模式，對酶促反應體系中的NADPH進行分析。NADPH的峰面積與其濃度在0.05～50 μmol/L范圍內呈良好的線性關系（r>0.9996），定量限（S/N=10）為0.05 μmol/L。

關鍵詞：超高效液相色譜串聯質譜； 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸； 3羥基3甲基戊二酰輔酶A還原酶； 抑制劑篩選

體內過多的膽固醇會引起血脂偏高，進而誘發冠心病、心肌梗塞等心血管疾病，因此HMGCR成為治療此類疾病的主要靶標酶[2]。目前，臨床治療高膽固醇癥的藥物主要為他汀類藥物（如普伐他汀），該類藥能夠競爭性的抑制HMGCR的活性，從而達到降低膽固醇的合成速率，降低血脂的目的，但其副作用近年來也屢見報道[3，4]。因此開發新型的副作用小、效果明顯的HMGCR抑制劑，特別是從天然產物中篩選其抑制劑，已成為當今降血脂藥物研發的一大熱點。

以往體外篩選HMGCR抑制劑，主要利用分光光度法[5]和HPLC法[6]，通過檢測上述反應中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， NADPH）的量的改變來評價HMGCR的活性變化。然而由于NADPH極性太大，在C18色譜柱里幾乎沒有保留，且很多天然產物都有很強的紫外吸收，因此HPLC法無法將NADPH與抑制劑等酶促反應體系中其它物質分開，在篩選HMGCR抑制劑的時候容易造成數據不準確。本研究利用超高效液相色譜串聯質譜儀（UPLCMS/MS）檢測酶促反應體系中NADPH濃度變化，快速篩選HMGCR抑制劑的方法。該方法通過引入離子化試劑三乙胺/六氟異丙醇（TEA/HFIP），顯著增強了NADPH的質譜信號。相比紫外檢測器有更強的信號，使得NADPH可以用質譜確證分析檢測，相比HPLC法更為準確，特別適用于復雜天然產物中HMGCR抑制劑的篩選。同時對色譜分離中的色譜柱和流動相對分離效果的影響進行了探討，優化了HMGCR酶促反應體系。利用本方法對綠茶、普洱茶和紅茶對HMGCR的抑制效果進行了比較。