置換型熒光偏振免疫檢測除草劑丁草胺

摘要：建立了一種置換型熒光偏振免疫分析方法（DFPIA）檢測水樣中除草劑丁草胺。研究了不同結構示蹤物對丁草胺DFPIA靈敏度的影響，優化篩選出一種熒光示蹤物抗體組成的免疫復合物；考察了DFPIA置換反應動力學。所建立的DFPIA法特異性良好，檢出限為22.6 μg/L，半數抑制濃度（IC50）為321.3 μg/L，檢測范圍為60～1472 mg/L，檢測時間為12.5 min，添加回收率在88.1%～112.5%間，免疫復合物可以在4 ℃下穩定保存至少1星期以上。本方法適于環境水樣中丁草胺的篩選檢測。

關鍵詞：熒光偏振免疫分析； 丁草胺

1引言

丁草胺（結構見圖1）屬于氯乙酰苯胺類除草劑，是一種高效芽前選擇性除草劑，主要用于去除稻田雜草，是我國生產和使用量最大的除草劑品種之一。丁草胺在環境中穩定性強、殘留期長，對環境和生物有一定的危害性[1]。目前，對除草劑的檢測主要是以氣相色譜或液相色譜為基礎的方法[2，3]。盡管儀器分析法準確可靠，但前處理操作繁瑣，需較高技能的專業人員操作，成本較高。近年來，快速、簡便的免疫分析方法在農藥殘留分析領域的應用已成為研究熱點之一[4]。

熒光偏振免疫分析（Fluorescence polarization immunoassay，FPIA）作為一種均相免疫分析方法，無需分離洗滌步驟，反應時間基本上取決于分析試劑加入的時間，為高通量、自動化免疫分析的實現展示了良好的應用前景[5，6]。 但目前在食品、環境污染物分析領域中研究應用很少[6～10]。本研究組曾建立了一種基于競爭原理的丁草胺熒光偏振免疫分析方法[8]，使用時先加入分析物和示蹤物，然后加入抗體，標記抗原和分析物開始競爭結合抗體，平衡后進行檢測。本研究采用基于置換原理的單試劑熒光偏振免疫分析方法（Displacement FPIA，DFPIA）檢測丁草胺，預先將抗體和熒光示蹤物混合制備出免疫復合物貯存待用，使用時只需將分析物加入，經短時間反應，測定熒光偏振信號。考察了結合反應動力學、置換反應動力學、方法特異性、穩定性、添加回收率等，建立了一種丁草胺DFPIA分析方法。2實驗部分

2.1儀器與試劑

Wallac VICTOR3 1420多標記分析儀（美國Perkin Elmer公司）；U3010 紫外可見光譜掃描儀（日本Hitachi公司）；熒光微孔板（深圳金燦華實業有限公司）。丁草胺（分析純，山東濱州農藥公司）；牛血清的蛋白（BSA）、異硫氰酸熒光素異構體Ⅰ（FITC isomer Ⅰ）、5氨基熒光素（AF）、N，N′二環己基碳二亞胺（DCC）、N羥基琥珀酰亞胺（NHS）、乙二胺、己二胺（Sigma 公司）；其它試劑均為市售分析純；硼酸緩沖液（BB溶液，50 mmol/L，pH 8.0）作為稀釋液用于所有樣品稀釋。

2.2實驗方法

2.2.1熒光示蹤物制備

丁草胺半抗原BMPA、不同長度手臂的熒光示蹤物BMPAAF、BMPAEDF和BMPAHDF（結構見圖1），按照文獻[8]的方法制備。