在線二維柱切換高效液相色譜法同時測定嬰幼兒強化奶粉中維生素A、D3和E的含量

摘要：使用雙梯度液相色譜系統紫外檢測器，建立了二維液相色譜法全自動、快速、同時測定嬰幼兒奶粉中維生素A，D3，E的含量。采用了非水反相系統，以Acclaim C18柱為一維分析柱，Acclaim PAⅡC18柱為二維分析柱。利用一維色譜柱完成維生素A和E的分離測定和維生素D的凈化分離；利用二維色譜柱完成維生素D的分析。一維分析以乙腈甲醇體系作為流動相，流速0.6 mLmin；二維分析以乙腈異丙醇體系作為流動相，流速0.8 mLmin，梯度洗脫。檢測波長為325， 296和263 nm，采用波長切換方式，整個分析過程僅需28 min。維生素D3在 20～2000 靏L范圍內的相關系數r為0.9998，平均回收率為100.7%；維生素A在1.71～855 mgL濃度范圍內的相關系數r為0.9979，平均回收率為114%；維生素E在 4.12～1030 mgL范圍內的相關系數r為0.9995，平均回收率為94.0%。本方法可快速準確測定嬰幼兒乳品中維生素A、D3和E的含量。

關鍵詞：高效液相色譜； 二維色譜柱； 雙樣充系統；嬰幼兒配方奶粉；維生素D； 維生素A； 維生素E

1引言

嬰幼兒配方奶粉又稱為母乳化奶粉，是一種以牛乳（或其它動物乳）為主要原料，通過調整成分模擬母乳，可供嬰幼兒生長和發育所需要的一種人工食品[1]。根據國家標準中有關奶粉營養成分規定，維生素指標中必須強化的包括維生素A、維生素D和維生素E及其它水溶性維生素等；其中維生素D在實際母乳中含量極低，約為4～40 IU（國際單位）L（0.1-1.0靏L）[2～4]，主要對應形式為維生素D3和25OH 維生素D3[4，5]，因此通常將維生素D3制成水可分散性的微粒形式，添加到嬰幼兒強化奶粉中[5，6]。關于奶粉中維生素A、D和E的測定方法的報道較多，其中高效液相色譜法是常用的分析方法。由于樣品基質復雜，3種維生素對溫度、光照、氧氣和極端的pH值較敏感，且多數經過包被后再添加到食品基質中[7]，因此分析方法常包括皂化破壁、有機溶劑萃取，濃縮和凈化等步驟[8，9]，在現行標準分析方法中[9]， 需采用正相制備色譜、反相分析色譜兩套儀器，分別進行凈化制備和分析，前處理過程極其繁瑣，大大影響樣品分析效率。本研究采用在線二維柱切換高效液相色譜紫外檢測法，樣品經過皂化、萃取后，直接進樣，同時完成維生素A， D和E的分析測定，提高了方法的準確性和樣品分析效率。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

3結果與討論

3.1二維色譜流路構建和閥切換時間的確定

維生素A和E在配方奶粉中含量較高，樣品經過皂化萃取后，可直接在一維色譜柱中實現分離。維生素D含量較低，且樣品基質干擾較大，原標準方法需經過正相制備色譜的凈化，將含有維生素D的餾分蒸干定容后，再在反相色譜上進行分析[9]。本研究采用二維色譜分離的中心切割法，樣品在一維色譜柱實現初步分離后，將含有維生素D的餾分切割至二維色譜柱中進行分離。系統連接圖見圖1。

為確定右側閥的準確切換時間，實驗將一維色譜柱直接與UV連接，進標準品溶液，測定維生素D2的出峰時間和維生素D3完全洗脫出色譜柱的時間。由于外界因素影響，維生素D的保留時間會有微小波動，切割的時間窗太窄容易造成目標物的損失；時間窗太寬，會使切換到二維分離柱的溶劑體積過大，對二維分離產生溶劑效應。本實驗通過連續進樣，考察了保留時間波動范圍，確定了最終的切換時間。在一維色譜分離中，維生素A和E在12 min內即可完成分離過程，而在二維色譜分離中維生素D的保留時間約為21～22 min，因此方法采用二位置六通閥實現了色譜柱后的紫外檢測器共用。左側閥的切換時間定在12 min，在12 min之前，一維色譜柱與檢測器連接；在12 min之后，二維色譜柱與檢測器連接，從而實現維生素A、D和E的同時檢測。閥切換時間見表2。

3.2色譜分離條件選擇

在色譜分離模式選擇上，文獻[10]采用正相色譜或反相色譜法進行分析。反相色譜法的優勢是可以將維生素D2、D3以及維生素D前體和非活性的異構體分開，因此可以選擇維生素D2作為內標，以補償在前處理過程中維生素D3的損失，提高測定結果的準確性和可靠性[10]。另外，考慮到流動相的兼容性，本實驗在一維色譜和二維色譜分離中均采用反相色譜法。