125I－USPIO－bevacizumab用于肝細胞肝癌的SPECT／CT／MRI多模態顯像研究

趙焱昭 姚琦 吳冰 譚輝 鄔鵬躍 張春富 程登峰 石洪成

（1.復旦大學附屬中山醫院核醫學科，上海 200032；2.上海市影像醫學研究所，上海 200032；3.上海交通大學Med－X研究院，上海 201101）

肝細胞肝癌（HCC）的早期診斷和治療非常重要，腫瘤直徑大于2 cm而不超過2 cm的HCC患者行肝癌切除術后5年生存率接近100%；腫瘤直徑不超過5 cm以及大于5 cm的HCC患者行腫瘤切除術后5年生存率分別為63.7%和34.9%［1－2］。影像學檢查是早期診斷HCC的重要方法。然而，單一的影像學技術對于診斷HCC有許多局限，如能聯合應用其他多種成像技術，則可實現優勢互補，為診斷HCC提供更加精確、全面的信息。本研究用直徑小于20 nm的超小超順磁性氧化鐵顆粒（ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO）偶聯bevacizumab，合成 USPIO－bevacizumab，再經125I標 記，合 成125I－USPIO－bevacizumab，將 其 作 為SPECT／MRI雙模一體靶向腫瘤細胞的分子探針，對HepG2 HCC模型鼠進行活體SPECT／CT及MRI顯像，以探討其用于HCC多模態顯像的潛力。

1 資料與方法

1.1 儀器 NanoSPECT／CT（美國Bioscan公司）；Magnetom Trio 3.0T超導型磁共振成像儀（德國Siemens公司）；CRC－15R活度計（美國Capintec公司）

1.2 試劑USPIO由上海交通大學Med－X研究院提供；bevacizumab購自瑞士Roche公司；二乙基三胺五乙酸（DTPA）、1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N－羥基琥珀酰亞胺 （NHS）、吐溫、二乙基三胺五乙酸二酐（DTPA二酐）、四氯二 苯 基 甘 脲 （Iodogen ）、COOH－PEG－COOH、COOH－PEG－NH2購自美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自北京索萊寶科技有限公司；高锝酸鈉（Na99mTcO4）淋洗液、碘125－碘化鈉（Na125I）溶液購自上海欣科醫藥有限公司；Whatman 3MM層析色譜紙購自美國GE公司；二氯甲烷、氯化亞錫、丙酮購自上海紅星試劑廠。

1.3 細胞 人HCC細胞株HepG2由復旦大學肝癌研究所提供。用DMEM培養基（內含體積分數為10%小牛血清、青霉素100 U／mL和鏈霉素100 μg／mL）在37℃、CO2體積分數為5%的條件下培養HepG2，每隔48 h換液1次；用0.05%胰酶（含0.02%EDTA）消化，并傳代。

1.4 裸鼠HCC皮下移植瘤模型的建立 SPF級Balb／c雄性裸鼠（4～6周齡，15～20 g）購自復旦大學實驗動物科學部。收集對數生長期的HepG2細胞，用0.1 mol／L的PBS調節細胞濃度至1×108個／mL；在Balb／c雄性裸鼠左肩處皮下注射0.1 mL細胞懸液；當腫瘤體積達100～300 mm3時（注射后1～2周），對荷瘤裸鼠行相關動物實驗。所有動物實驗研究均遵守復旦大學附屬中山醫院實驗動物管理規范。

1.5 USPIO－bevacizumab的合成 USPIO－bevacizumab的合成路線如圖1所示。實驗流程：以0.01 mol／L PBS（pH＝7.4）為溶劑配制 COOH－PEGCOOH 及COOH－PEG－NH2溶液，濃度均為1 mg／mL。將 2 mL COOH－PEG－NH2、2mL COOHPEG－COOH、4 mL Fe3O4透析液以及22 mL0.01 mol／L PBS（pH＝7.4）混合，配制30 mL USPIO混合液，室溫下超聲1 h。

圖1 USPIO－bevacizumab的合成路線

將上述30 mL USPIO（20μg／mL）混合液置于最大分離范圍為10 kD的超濾管中，以5000 r／min離心10 min，離心后上層剩余溶液約5 mL；再加入PBS5 mL，5000 r／min離心10 min，重復2次，除去游離的PEG；然后將離心后殘留液體轉移至最大分離范圍3 kD的超濾管中，6000 r／min離心15 min，此時管中殘留液體約2 mL；將剩余溶液靜置后可觀察到沉淀，上清液呈深棕色，為COOH－PEG－NH2／Fe3O4／COOH－PEG－COOH 納米磁流體。

向8 mL PBS中加入2μL吐溫并混合；將10 mg EDC和10 mg NHS溶于200μL該混合液；將200μL含有EDC和NHS的溶液加入到前述離心后得 到 的 2 mLCOOH－PEG－NH2／Fe3O4／COOH－PEG－COOH納米磁流體中；溶液振蕩30 min后轉移至最大分離范圍3 kD的超濾管中，6000 r／min離心5 min；加入25 mg／mL的bevacizumab50μL，在37℃的恒溫培養箱中以250 r／min的速度振蕩2 h；得到 USPIO－bevacizumab 1.5 mL，其中含鐵0.15 mg，bevacizumab 1.25 mg。

1.6125I標記bevacizumab及 USPIO－bevacizumab在涂有Iodogen（約10μg）的反應管中依次加入2 μL bevacizumab（25mg／mL）、50μL Na125I的 PBS溶液（370 MBq／mL，PBS：0.05 mol／L），輕輕混勻后，室溫反應10 min。用甲醇和水的混合溶液作為展開劑，用Whatman3mm層析試紙為固定相測定標記率，125I－bevacizumab的Rf＝0，Na125I的Rf＝0.8。

1.7 HepG2荷瘤裸鼠顯像

1.7.1 注射125I－bevacizumab后 HepG2荷瘤裸鼠的NanoSPECT／CT顯像 荷瘤裸鼠的 Nano－SPECT／CT顯像在復旦大學附屬腫瘤醫院核醫學科進行。取1只HepG2荷瘤裸鼠，經尾靜脈注射100μL含37 MBq125I－bevacizumab的PBS溶液；分別在注射后2 h以及24 h腹腔注射100μL2.5%巴比妥鈉麻醉裸鼠，行NanoSPECT／CT全身顯像，監測小鼠體內腫瘤對125I－bevacizumab的吸收情況。小鼠在進行SPECT顯像之前首先進行CT掃描，CT掃描參數：幀分辨率256×512，球管電壓45 kVp，電流0.15 mA，曝光時間500 ms／幀，小鼠全身掃描時間約為7 min；在采集圖像的同時采用Nucline 1.02軟件（匈牙利Mediso公司）進行實時圖像3D重建。CT掃描結束后，進行同機SPECT掃描，SPECT掃描選用4個高分辨9孔板，配合錐形準直器同時實現圖像的高分辨及高靈敏度，能峰28 keV，窗寬10%，掃描參數選擇1 mm／pixel的分辨率、256×256的矩陣排列以及24個投影和60 s掃描時間，小鼠全身掃描約需24 min；掃描完成后，采用Hi－SPECT軟件 （美國Bioscan公司）進行3DOSEM重建圖像，重建算法采用4個子集及6次迭代計算，重建分辨率為0.4 mm／pixel。

1.7.2 注射125I－USPIO－bevacizumab后 HepG2荷瘤裸鼠的NanoSPECT／CT顯像 取1只HepG2荷瘤裸鼠，經尾靜脈注射含100μL37 MBq125I－USPIO－bevacizumab的PBS溶液，分別在注射后2 h以及24 h腹腔注射100μL2.5%巴比妥鈉麻醉裸鼠，行NanoSPECT／CT全身顯像，監測小鼠體內腫瘤對125I－USPIO－bevacizumab的吸收情況。采集和重建處理參數見1.7.1。

1.7.3 注射 USPIO－bevacizumab后 HepG2荷瘤裸鼠的3T Trio磁共振成像 磁共振成像在華東師范大學認知神經科學研究所進行：取1只HepG2荷瘤裸鼠，經腹腔注射100μL2.5%巴比妥鈉麻醉，采用3T Trio磁共振成像系統行全身顯像；然后經尾靜脈注射含100μL USPIO－bevacizumab的PBS溶液，24 h后腹腔注射100μL2.5%巴比妥鈉麻醉裸鼠，采用3T Trio磁共振成像行全身顯像，監測小鼠體內腫瘤對USPIO－bevacizumab的吸收情況。2次3T Trio磁共振成像的掃描參數一致，均為：TR＝1500 ms，TE＝75 ms，FOV＝75 mm×100 mm，矩陣 ＝192×256，層厚 ＝2 mm。掃描完成后，所有磁共振圖像經目測均匹配相應層面的模型鼠腫瘤信號改變。

1.8 免疫組化染色 尾靜脈注射125I－USPIO－bevacizumab的荷瘤裸鼠行NanoSPECT／CT顯像后斷頸處死，取腫瘤組織，經質量濃度為4%的甲醛固定，石蠟包埋，以4μm的厚度連續切片，分別作VEGF和CD34免疫組化染色。

2 結 果

2.1 以125I－bevacizumab為分子探針的HepG2荷瘤裸鼠的NanoSPECT／CT顯像 通過紙層析法測得125I－bevacizumab的標記率為92.5%。HepG2荷瘤裸鼠注射125I－bevacizumab 后，2 h 及 24 h 的SPECT／CT顯像（圖2），在這兩個時間點均可見明顯的腫瘤放射性濃集；從2 h到24 h，背景放射性逐漸降低，感興趣區（ROI）定量分析顯示，腫瘤的放射性吸收（ID%）從2.3% （2 h）上升至2.5% （24 h）。

圖2 HepG2荷瘤裸鼠注射125I－bevacizumab后2h（A）和24h（B）NanoSPECT／CT顯像

2.2 以125I－USPIO－bevacizumab 為分子探針的HepG2荷瘤裸鼠的 NanoSPECT／CT顯像HepG2荷瘤裸鼠經尾靜脈注射125I－USPIO－bevacizumab后，2 h及24 h行NanoSPECT／CT顯像（圖3），在這2個時間點腫瘤組織均有放射性攝取；ROI定量分析發現，腫瘤組織的放射性吸收（ID%）為0.54%（2 h）和1.04%（24 h），背景的放射性攝取隨時間延長逐漸降低。

圖3 HepG2荷瘤裸鼠注射125I－USPIO－bevacizumab后2h（A）和24h（B）NanoSPECT／CT顯像

2.3 HepG2荷瘤裸鼠注射 USPIO－bevacizumab后的3T Trio MRI顯像 HepG2荷瘤裸鼠尾靜脈注射USPIO－bevacizumab前后均行3T Trio MRI T2 WI加權顯像（圖4）。注射顯像劑后，模型鼠肝臟與腫瘤組織同一層面的信號均較注射顯像劑前低，顯示為明顯的T2效應（信號丟失）?？赏ㄟ^腫瘤部位和肝臟區域的不同減低程度來勾畫出感興趣區。

圖4 HepG2荷瘤裸鼠注射USPIO－bevacizumab前（A）和注射后24h（B）的3TTrio MRI顯像

3.4 HepG2荷瘤裸鼠注射125I－USPIO－bevacizumab后的免疫組化染色 CD34在HepG2肝癌組織間的血竇內皮細胞的胞質內呈強表達，顯示為強棕黃色，表明有新生血管的存在；肝癌細胞的胞質內彌漫表達VEGF，表達強度為中等。

圖5 HepG2荷瘤裸鼠注射125I－USPIO－bevacizumab后免疫組化染色：CD34（A），VEGF（B）

3 討 論

HCC的功能性核醫學顯像手段主要包括PET和SPECT。PET具有高靈敏度以及高分辨率的特點，對早期診斷HCC有較高價值；然而，目前最常用的PET顯像劑氟代脫氧葡萄糖（18F－FDG）用于HCC的診斷時，陽性檢出率僅為50%［3］。其他的PET分子探針，如11C標記的乙酸鹽（11C－acetate）、膽堿（11C－choline）與FDG比較，陽性檢測率有所提高，但是，它們均不適用于體積較小、分化程度較高的惡性HCC以及腫瘤轉移灶的檢測［4］。MRI對于HCC的診斷及預后評估有較高的價值，可提供精確的解剖影像，且具有低電離輻射、高軟組織對比度和靈敏度等優點。然而，盡管MRI診斷HCC的敏感度達80%，但仍有30%～50%的肝內病灶（直徑大多＜2 cm）被漏診［5］。目前，釓、鐵等的造影劑已經被應用于MRI分子影像領域。USPIO作為MRI陰性造影劑，能在T2 WI上表現為低信號，具有良好的T2 WI加權成像的對比增強效果，因此已用作MRI的分子探針［6］。

多模態成像技術能夠同時提供高特異性的功能成像信息和高靈敏度、高對比度的解剖成像信息，優于任何一種單一形式的影像技術。目前，PET／SPECT／MRI多模態成像技術，尤其是在多模態納米探針的研究方面，已取得很大進展［7］。USPIO共價耦聯間皮素表達的結合抗體mAbMB并進行111In標記的產物111In－mAbMB－USPIO已被應用于胰腺癌腫瘤的SPECT／MRI研究［8］。經DTPA修飾的USPIO偶聯乳糖酸并進行99mTc標記的產物99mTc－DTPA－SPION－LBA也已被應用于HepG2肝細胞癌的SPECT／MRI雙模態顯像前期研究［9］。

VEGF與HCC的發展及轉移密切相關［10］，故選擇VEGF作為HCC顯像的靶點有利于提高顯像的特異性并有助于肝癌的分期診斷及療效評價。bevacizumab是美國食品和藥物管理局（FDA）批準的第一個抗血管生成類抗體藥物，能特異性地結合VEGF－A。目前，標記111In和89Zr的bevacizumab已被成功用于宮頸癌的SPECT以及PET顯像［11］。

通過以上分析發現，以bevacizumab作為靶向分子，偶聯USPIO并進行同位素標記，可以作為SPECT／PET／MRI顯像劑并能很好地用于 HCC顯像。采用與124I核素原子結構及標記方法類似的125I核素標記納米顆粒進行SPECT以及MRI顯像，具有一定的研究價值。

本研究中，HepG2荷瘤裸鼠注射125I－bevacizumab后，腫瘤部位呈現出明顯的放射性濃集，且隨著時間的延長，放射性濃集進一步加強，顯示了125I－bevacizumab的腫瘤靶向性及特異性。HepG2荷瘤裸鼠注射125I－USPIO－bevacizumab后，腫瘤的攝取較注射125I－bevacizumab后弱，而在肝臟的放射性濃集較125I－bevacizumab注射后進一步增強。肝臟保持較高的放射性濃集與正常肝臟中大量枯否細胞（Kupffer cell）對納米顆粒的吞噬作用有關。但是，我們也發現，直接應用125I標記的bevacizumab顯像時，放射性信號主要集中在腫瘤組織的邊緣；然而，125I標記的bevacizumab與USPIO偶聯后，放射性信號可在腫瘤的中央部位發現，在實體瘤內部分布更加均一；這符合納米顆粒在實體瘤內的高通透性和滯留效應（EPR效應）。盡管本研究中肝臟放射性背景較高，但因腫瘤對125I－USPIO－bevacizumab的吸收主要是與腫瘤組織新生血管內皮細胞及腫瘤細胞分泌的VEGF有關，故通過該特異性濃集能反應腫瘤的生長情況。僅通過SPECT顯像難以精確勾畫出腫瘤組織，本研究以USPIO作為bevacizumab的載體，因USPIO為磁性四氧化三鐵，當納米顆粒直徑小于30nm時則具有超順磁性，故可用于MRI顯像（本實驗采用的USPIO經光鏡分析微粒直徑小于20nm）；因此，借助 MRI T2 WI加權顯像對ROI進行勾畫，再借助融合軟件對SPECT的吸收進行定量分析，可對HCC的病理學進程進行活體在線定量分析。

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