太空誘變對紫花苜蓿耐鹽性及離體再生的影響

郭慧琴　李晶　任衛波　陳立波　劉雅學　趙海霞

摘要：為了揭示太空誘變對苜蓿耐鹽能力的影響，以搭載種子、未搭載苜蓿種子及耐鹽品種中苜1號為材料，研究了鹽脅迫下苜蓿種子發芽及其再生能力的變化。結果表明，太空誘變后，苜蓿耐鹽性與未搭載和中苜1號相比顯著增強，250 mmol/L NaCl脅迫下種子發芽率比未搭載增加25.7%，發芽時間縮短，子葉畸變率低。同時，搭載后的種子組培再生能力顯著增強，表現為愈傷誘導、胚狀體誘導、不定芽形成及根分化的數量和質量顯著高于未搭載對照及中苜1號。通過鹽脅迫條件下篩選，最終獲得3株耐鹽變異材料。

關鍵詞：紫花苜蓿；誘變；空間搭載；耐鹽；離體再生

中圖分類號：S 541.035 文獻標識碼：A 文章編號：10095500（2013）01002504

太空誘變是利用近地空間環境中重粒子輻射＼[1-3＼]、微重力＼[4-6＼]、弱磁場＼[4＼]等因素，對搭載植物材料進行誘變，從而通過篩選獲得有益變異材料＼[7＼]。紫花苜蓿（Medicago sativa）是重要的多年生豆科牧草，因具有高蛋白、富含維生素、適口性好等優點，被廣泛種植。開展苜蓿種子太空誘變效應研究，對于篩選優異變異材料，加快新品種選育具有重要意義。

已有的研究表明，紫花苜蓿種子經過太空誘變后，染色體、細胞核畸變率顯著提高＼[8＼]，誘變效應顯著。進一步分析表明，搭載后苜蓿的株高、初級分枝數、定植當年的單株生物量、葉數等重要的經濟性狀均可發生顯著變化，通過篩選，有望獲得優質、高產的變異材料＼[9-11＼]。此外還發現，經過太空誘變后，苜蓿葉片厚度、柵欄組織厚度均大于對照，這可能影響其抗逆性＼[11＼]。然而，有關太空誘變對苜蓿耐鹽能力影響的研究相對較少。通過研究250 mmol/L NaCl脅迫下苜蓿種子發芽能力及組培再生能力的變化，揭示太空誘變對苜蓿芽期耐鹽能力的影響，為獲得耐鹽變異材料提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試苜蓿品系種子由中國農業科學院草原所提供，隨機分為2份，1份作為地面未搭載對照（ck），另1份用于太空搭載。搭載種子封入布袋，搭載于我國發射“實踐八號”育種衛星（2006.9.92006.9.24）進行太空誘變處理。對照品種中苜1號（Medicago sativa cv.Zhongmu No.1）種子由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所惠贈。

1.2 試驗方法

1.2.1 鹽脅迫濃度優化 供試種子消毒（75%酒精浸1 min+30% H2O2浸泡30 min）后，用無菌水沖洗干凈，接種于無菌苗培養基（MS+7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖）進行發芽試驗。鹽濃度設置5個水平：0、50、100、150和250 mmol/L。每個水平設4個重復，每個重復50粒種子。培養條件，25 ℃，光照強度2 500 lx，光暗周期16 h/8 h。1周后開始統計正常種苗數、不正常種苗數、死種子數，并計算種子發芽率。

發芽率=正常種苗數/供試種子數×100

子葉畸變率=畸變子葉種苗數/供試種苗數×100

1.2.2 耐鹽植株再生 在250 mmol/L NaCl脅迫下，選取生長健康的無菌苗，切取子葉、下胚軸進行愈傷組織誘導，愈傷誘導培養基SH+2，4D（3.0 mg/L）+6BA（0.5 mg/L）+7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖+250 mmol/L NaCl。獲得愈傷組織經胚狀體誘導，培養基為＼[SH+2，4D（3.0 mg/L）+6BA（0.5 mg/L）+水解酪蛋白10 g/L+7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖+250 mmol/L NaCl＼]、分化（MS+7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖+250 mmol/L NaCl）和生根（1/2 MS+7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖）培養，最終獲得再生植株。

2 結果與分析

2.1 不同濃度NaCl脅迫對紫花苜蓿發芽的影響

當NaCl濃度0～150 mmol/L時，隨著濃度的增加，苜蓿種子發芽率略微降低，差異不顯著（圖1）。當濃度為250 mmol/L時，苜蓿種子發芽率比正常水平（0 mmol/L NaCl）降低26%，差異極顯著（P<0.01）（圖1）。此外，在250 mmol/L NaCl脅迫下，苜蓿種子發芽時間從7～10 d延長至31～33 d，發芽時間延長了近3倍，多數種苗出現生長緩慢、子葉發白、畸變率高。因此，選定250 mmol/L NaCl作為篩選耐鹽突變體的鹽濃度。

2.2 太空誘變對紫花苜蓿耐鹽發芽能力的影響

無鹽脅迫，中苜1號、地面對照及搭載種子發芽率達到98%以上，三者間無顯著差異，此外種苗生長健康，無明顯畸變。在250 mmol/L NaCl脅迫下，中苜1號和地面未搭載對照種子發芽率顯著降低，發芽天數由原來的7 d增加到20 d。與未搭載對照和中苜1號相比，太空誘變種子發芽率分別比未搭載對照和中苜1號高25%和27%，差異極顯著（P<0.01）（表1）。此外，搭載后苜蓿種苗生長健康，多數種苗無失綠、畸變等現象。

2.3 太空誘變對紫花苜蓿NaCl脅迫下組織培養再生能力的影響

在250 mmol/L NaCl脅迫下，與未搭載對照相比，太空誘變組培再生能力顯著增強，主要表現為子葉愈傷誘導率、子葉胚狀體誘導數、胚軸愈傷誘導率、胚軸胚狀體數顯著提高（P<0.05）（圖2）。中苜1號與未搭載對照間無顯著差異。

在高鹽脅迫下，地面未搭載對照外植體會在培養過程中出現變白而凋亡，多數無法形成正常愈傷；即使少量可以形成愈傷，但愈傷組織顏色較淺，結構松散，不利于不定芽的形成及根分化（圖3）。

與對照相比，搭載后種子組織再生能力顯著增強，可形成高質量的愈傷組織，主要表現為愈傷組織顏色深綠，結構緊湊，且其表面容易形成較大的不定芽，通過分化，可獲得完整植株。最終通過多次篩選，獲得3株耐鹽變異植株。

3 討論與結論

研究發現，經太空誘變后，苜蓿種子耐鹽發芽能力顯著提高，表現為種子發芽速度快，發芽率顯著提高。這與已有的研究結果基本一致。杜志釗等＼[12＼]研究發現，經過太空搭載后，在0.5% NaCl脅迫下，飛行組大麥種子的發芽率比對照高34%；在1.0% NaCl脅迫下，飛行組種子發芽率比對照高40%，表明太空誘變可顯著提高大麥種子芽期耐鹽能力。陸瑞菊等＼[13＼]研究發現，經過空間搭載后，大麥種子鹽脅迫發芽能力顯著提高，表現為250 mmol/L NaCl脅迫下，大部分飛行材料主根長度、發根數、發芽率等顯著提高。

注：1～3分別為未搭載對照下胚軸誘導愈傷組織、不定芽和再生苗；4～6分別為太空誘變材料誘導愈傷組織、不定芽和再生苗

太空誘變與組織培養相結合是篩選抗逆脅迫變異品系的有效途徑之一＼[17＼]。苜蓿的組培再生能力受基因型、外植體類型、激素配比等因素影響＼[14-16＼]。研究發現，太空誘變對苜蓿鹽脅迫下組培再生能力有顯著影響，表現為愈傷組織、不定芽形成速度與質量顯著提高。這與搭載后苜蓿耐鹽能力增強有關。這與已有的研究結果基本一致。亞麻種子經過太空誘變后，其后代抗NaCl、PEG能力增強，通過組培得到抗1.2 % NaCl的變異系。當NaCl濃度在0.9%時，變異系相對生長量（脅迫條件下實際生長量/無脅迫條件下生長量）保持70%，而此時對照只要10%。對照系在鹽濃度大于1.2%時生長完全被抑制，變異系明顯表現出對鹽抗性＼[18＼]。

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