青天葵中鼠李檸檬素在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

蔡周權(quán)，袁浩宇，龍恩武

(1．四川省科學(xué)城醫(yī)院藥劑科，四川 綿陽(yáng) 621900;2．核工業(yè)四一六醫(yī)院藥劑科，四川 成都 610051;3．四川省人民醫(yī)院藥學(xué)部，四川 成都 610072)

青天葵是我國(guó)傳統(tǒng)出口中藥，主要產(chǎn)于廣東、廣西、云南、四川等地[1]。青天葵清熱解毒、清肺止咳效果顯著，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)其具有抗病毒、抗腫瘤及免疫增強(qiáng)作用，是一種藥理作用顯著、臨床療效確切的特產(chǎn)藥材[2-3]。目前，青天葵的公開(kāi)報(bào)道不多，其研究多在資源、性狀、栽培、成分分析上，尚未見(jiàn)其體內(nèi)過(guò)程的報(bào)道。鼠李檸檬素是青天葵中重要的黃酮類(lèi)化合物[4]，也是質(zhì)量控制中常用的重要指標(biāo)之一[5]。本研究中以青天葵中鼠李檸檬素為指標(biāo)，建立了血藥濃度測(cè)定方法，并對(duì)大鼠口服后的體內(nèi)情況進(jìn)行研究，為全面評(píng)價(jià)青天葵質(zhì)量、制劑開(kāi)發(fā)及臨床應(yīng)用等奠定藥代動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

LC-2010C HT型高效液相色譜儀(日本島津)，紫外檢測(cè)器、泵及柱溫箱;BS210S型電子天平(德國(guó)賽多利斯);TGL-16型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng));YHK-Ⅱ型液體快速混合器(江西醫(yī)療器械廠(chǎng))。鼠李檸檬素對(duì)照品(自制，經(jīng) UV，IR，MS，NMR確證結(jié)構(gòu)，純度大于98%);青天葵提取物(自制，鼠李檸檬素純度大于85%);甲醇、乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher公司);水為重蒸水;其余試劑均為分析純。健康SD大鼠(體重250～300 g，雌雄各半)，購(gòu)自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，試驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

2 方法與結(jié)果

2．1 溶液制備

取鼠李檸檬素對(duì)照品約25 mg，精密稱(chēng)定，置25 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解稀釋并定容，搖勻即得濃度為1 000 μg/mL的貯備液，4℃冷藏保存。取青天葵提取物適量，置25 mL容量瓶中，重蒸水超聲溶解，使鼠李檸檬素質(zhì)量濃度為7．5 g/L，作為大鼠灌胃液。

2．2 血漿樣品預(yù)處理

精密量取血漿樣品 100 μL，加入甲醇 20 μL，10%三氯乙酸溶液100 μL 沉淀蛋白，旋渦混勻 3 min，1．2×104r/min離心 5 min，精密量取上清液20 μL直接進(jìn)樣分析。

2．3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Hypersil C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)，加保護(hù)柱;流動(dòng)相:甲醇-乙腈-0．2%磷酸水溶液(30∶35∶35);檢測(cè)波長(zhǎng):366 nm;柱溫:35 ℃;流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL。在上述色譜條件下，測(cè)得空白血漿、空白血漿加鼠李檸檬素對(duì)照品及大鼠灌胃后2 h血漿樣品，色譜圖見(jiàn)圖1。可見(jiàn)，鼠李檸檬素保留時(shí)間約為14．5 min，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾鼠李檸檬素的分離測(cè)定。

圖1 高效液相色譜圖

2．4 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備:精密吸取鼠李檸檬素貯備液適量，分別用甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度的工作溶液，各取20 μL加入100 μL空白血漿中，使血漿質(zhì)量濃度分別為 0．05，0．10，0．25，0．50，1．00，2．50，5．00，10．00 μg/mL，按 2．2 項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄色譜圖和峰面積。以藥物峰面積(A)為縱坐標(biāo)血漿中藥物濃度(C，μg/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行加權(quán)回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程 A=1．26 × 103C-8．98 ×102(r=0．999 3，權(quán)重為 1/C2)。質(zhì)量濃度在0．05～10．00 μg/mL范圍內(nèi)，藥物峰面積與質(zhì)量濃度線(xiàn)性關(guān)系良好。檢測(cè)限為10 ng/mL。

方法回收率試驗(yàn):精密量取鼠李檸檬素工作溶液，各取20 μL加入100 μL空白大鼠血漿中，得低、中、高3個(gè)已知質(zhì)量濃度樣品，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方法計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

提取回收率試驗(yàn):精密量取鼠李檸檬素工作溶液，各取20 μL加入100 μL空白大鼠血漿，配制低、中、高3個(gè)已知質(zhì)量濃度樣品，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方法操作，記錄峰面積;另以水代替空白血漿，將低、中、高3個(gè)已知質(zhì)量濃度樣品按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方法操作，記錄峰面積。以前后2種處理測(cè)定得到的峰面積之比計(jì)算提取回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 提取回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

精密度試驗(yàn):按方法回收率試驗(yàn)項(xiàng)下方法，測(cè)定鼠李檸檬素0．10，1．00，10．00 μg/mL 3 個(gè)已知質(zhì)量濃度樣品，以 1 d 內(nèi) 5 次測(cè)定結(jié)果計(jì)算日內(nèi)精密度，1周內(nèi)3 d測(cè)定結(jié)果計(jì)算日間精密度。結(jié)果表明，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差分別為 3．95%，4．33%，3．36%，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差分別為 10．58%，9．89%，7．55%。

穩(wěn)定性試驗(yàn):配制低、中、高(0．10，1．00，10．00 μg/mL)3 個(gè)質(zhì)量濃度血漿樣品數(shù)份，按2．2項(xiàng)下方法操作，分別于室溫下放置0，1，2，4 h后測(cè)定，考察樣品在室溫條件下的穩(wěn)定性;放置于-20℃ 冰箱中反復(fù)凍融3次，考察凍融對(duì)藥物穩(wěn)定性的影響;在-20℃冰箱中冷凍15 d后，考察藥物冷凍放置的穩(wěn)定性。結(jié)果的RSD值均小于10%，表明血漿樣品在室溫下放置4 h、反復(fù)凍融3次、-20℃冰箱中冷凍保存15 d后穩(wěn)定性均良好，滿(mǎn)足樣品分析檢測(cè)要求。

2．5 動(dòng)物試驗(yàn)

SD大鼠8只，雌雄各半，試驗(yàn)前禁食12 h，全程不禁水;按120 mg/kg灌胃給予青天葵供試液，于給藥前及給藥后0．25，0．5，0．75，1，1．5，2，4，6，8，12，24 h 時(shí)尾靜脈斷尾取血約 0．3 mL，離心分離血漿，置-20℃冰箱中保存待測(cè)。血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。用DAS 2．1．1版藥代動(dòng)力學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果鼠李檸檬素在大鼠體內(nèi)過(guò)程符合二室模型，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

圖2 鼠李檸檬素血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)(n=8)

表3 灌胃給予青天葵后鼠李檸檬素的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n=8)

3 討論

鼠李檸檬素是青天葵中主要的黃酮類(lèi)成分之一，也是表征其質(zhì)量的重要成分。研究結(jié)果顯示，大鼠單劑量灌胃給予120 mg/kg青天葵提取物后，鼠李檸檬素體內(nèi)處置符合二室模型，約1．5 h達(dá)峰，吸收較為迅速;消除半衰期為(8．993±2．568)h，消除較慢;中心室分布容積為(196．122±26．983)L/kg，體內(nèi)分布廣泛。

青天葵藥用價(jià)值高，野生資源較緊缺，而對(duì)其藥學(xué)的研究多集中在資源、生物學(xué)、成分分析及療效上[6]，缺乏物質(zhì)基礎(chǔ)的體內(nèi)情況報(bào)道。本研究以其中代表性成分鼠李檸檬素為指標(biāo)，初步考察了大鼠口服后的體內(nèi)運(yùn)行過(guò)程，為青天葵藥材的全面質(zhì)量控制提供生物藥劑學(xué)指標(biāo)與方法，也為將來(lái)的口服制劑劑型設(shè)計(jì)、處方篩選、工藝優(yōu)化和質(zhì)量評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。

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