血漿miR-145在結直腸癌中的表達及臨床意義

黃偉 張樂鳴 張怡 陳瑩

血漿miR-145在結直腸癌中的表達及臨床意義

黃偉 張樂鳴 張怡 陳瑩

目的 研究miR-145在結直腸癌患者和健康者血漿中的表達差異，并探討其與臨床特征之間的關系。 方法 收集53例初治結直腸癌患者和26例健康者外周血漿，提取總RNA，用反轉錄及real-time PCR檢測miR-145的表達情況，分析其與臨床特征之間的關系，評估其對結直腸癌的診斷效能。 結果 miR-145在結直腸癌患者血漿中的表達較健康者顯著降低（P＜0.01），miR-145的AUC為0.859，鑒別結直腸癌患者的敏感性86.8%、特異性88.5%，但miR-145的表達水平與臨床特征（性別、年齡、腫瘤位置、淋巴結狀態、TNM分期、局部浸潤深度及CEA水平）之間均無相關性（均P＞0.05）。 結論 血漿miR-145有望作為結直腸癌的新型標記物，但可能只參與了結直腸癌發生的起始過程。

miRNA miR-145 結直腸癌 血漿

miRNA miR-145 Colorectal cancerPlasma

結直腸癌是人類常見的消化道惡性腫瘤。因其早期癥狀不典型，臨床缺乏有效的早期篩查方法，而腸鏡等侵入性檢查又降低了患者的依從性，大多數患者確診時已屬中晚期。因此，需要建立一個簡單、實用的早期篩查方法。MicroRNAs（miRNAs）是一類長約22個核苷酸，單鏈、內源性、高度保守的非編碼小分子RNA[1]。多項研究結果[2-4]顯示，miRNAs具有調控細胞發育、分化、增殖及凋亡等作用，并作為腫瘤性miRNAs（oncomiRs）或腫瘤抑制性miRNAs（ts-miRs）參與腫瘤的形成與演變，已被證實有潛力作為多種惡性腫瘤新型標記物。本研究采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）技術檢測結直腸癌患者及健康體檢者血漿中miR-145的表達水平，并分析與患者臨床特征之間的關系，探討其在結直腸癌患者中的臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集寧波市第一醫院2011-08—11的53例結直腸癌患者的血漿標本。53例均為腺癌，其中結腸癌17例，直腸癌36例。女15例，男38例，年齡28～80歲，中位年齡58歲。淋巴結轉移陽性者33例，陰性者20例。按照最新結直腸癌TNM分期，I期6例、Ⅱ期14例、Ⅲ期27例、Ⅳ期6例。另選取26例年齡、性別匹配的健康體檢者作為正常對照組，血清CEA、CA19-9及腹部CT均未見異常，無腫瘤病史。所有入組患者手術前均未經過放療及化療，且無合并癥。在采集標本前均征得本人同意，并簽署知情同意書，按2009年由國際抗癌聯盟（UICC）和美國腫瘤聯合會（AJCC）聯合制定的腸癌TNM分期法對結直腸癌病例進行病理學分型，以病理學診斷作為最終診斷。

1.2 標本處理和RNA提取 用EDTA管采集外周靜脈血5ml，常溫下4h內進行處理。血標本在4℃下1 200g離心10min，取上層血漿再在4℃下12 000g離心10min，再取上層血漿-80℃冰箱保存。總RNA提取：取-80℃冰箱保存的血漿標本400μl，采用美國Ambion公司生產的mirVana PARIS Kit，按說明書提取總RNA，用NanoDrop2000超微量分光光度計測定RNA濃度及OD260/ OD280比值，-80℃冰箱保存備用。

1.3 miRNA的cDNA合成 采用德國Qiagen公司生產的miScript Reverse Transcription Kit合成cDNA，反應條件為：37℃60min，95℃5min。反應結束后，合成的cDNA-20℃保存。

1.4 miRNA的熒光定量檢測 采用德國Qiagen公司生產的miScript SYBR Green PCR Kit進行real-time PCR檢測，所有反應采用2復孔。25μl的反應體系：2.5μl的 cDNA，12.5μl的 2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix，5.0μl的 RNase-free water，2.5μl的10×miScript Universal Primer，2.5μl的miRNAs特異前向引物，miR-145及U6的引物由上海捷瑞公司合成，miR-145引物序列為5′-GGCGTCCAGTTTTCCCAG-3′U6為5′-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3′。反應條件為：95℃15min，接著94℃15s，55℃30s，70℃34s，45個循環。采用ABI step-one plus實時定量PCR儀進行檢測，Ct值用SDS2.1軟件計算。檢測miRNA的相對表達定量時，以U6作為內參基因，采用2-△△Ct法進行結果分析，將不同樣本的相對表達定量值（relative quantity，RQ）進行比較。RQ=2-△△Ct，△△Ct=待測標本的△Ct-對照樣本△Ct，△Ct=目的基因Ct值-內參基因Ct值[5]。

1.5 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件，計量資料以表示，miRNAs相對表達量呈偏態分布、方差不齊，以中位數和四分位數間距表示；兩組間或多組間比較采用Mann-Whitney U檢驗或Kruskall-Wallis檢驗；應用ROC曲線評價診斷效能。

2 結果

2.1 結直腸癌患者與健康體檢者血漿中miR-145的表達 miR-145及U6的Realtime PCR擴增曲線均呈“S”型；PCR產物熔解曲線均為單峰，說明擴增的目的基因特異性好且結果可靠，見圖1。

圖1 Realtime PCR檢測患者與健康體檢查血漿中miR-145的表達（A：部分樣本的U6及miR-145擴增曲線；B：U6熔解曲線；C：miR-145熔解曲線）

以U6為內參，結直腸癌患者血漿中miR-145的RQ為0.407（0.244，0.912）；健康體檢者血漿中RQ為1.512（1.386，1.713）。采用非參數秩和檢驗，兩者差異有統計學意義（P＜0.01），見圖2。

2.2 血漿miR-145在結直腸癌中的診斷效能 根據ROC曲線分析，血漿miR-145的AUC為0.859（95%CI: 0.772～0.947），在最佳截斷值1.0568，血漿miR-145的敏感性為86.8%，特異性為88.5%，見圖3。

2.3 血漿miR-145的表達水平與結直腸癌患者臨床特征之間的關系 血漿miR-145的RQ與結直腸癌患者的性別、年齡、腫瘤位置、淋巴結狀態、TNM分期、局部浸潤程度及血清CEA水平無相關性（均P＞0.05），見表1。但在不同TNM分期的患者血漿miR-145的RQ與健康對照組均有統計學差異（均P＜0.01），然而其表達量未顯示出隨著TNM分期的增加而降低的趨勢，見圖4。

3 討論

提高癌癥早期階段的檢出率能顯著提高患者生存率，降低癌癥病死率及延長患者生存時間。目前的新型早期篩查方法主要是對腫瘤標記物的尋找，標本主要是血液、尿液、胸腹水等體液，相比傳統的組織標本來源更易獲得，對患者的創傷更小。自從Mitchell等[2]首次證實血漿中miRNA能鑒別出前列腺癌患者后，循環miRNA作為新型腫瘤標記物成為研究的熱點。最近，Allen等[6]研究發現血漿中miRNAs性質非常穩定，即便在100℃煮沸10min或室溫下放置不同的時間（4、12、24h）或反復凍融，其表達水平基本不變，這為今后的研究奠定了基礎。隨后在乳腺癌[7]、胃癌[8]、胰腺癌[9]、肝癌[10]及肺癌[11]等惡性腫瘤患者的血漿中發現：miRNAs異常的表達與組織病理學特征以及疾病的不同階段之間有著密切的關系。目前Slaby等[12]、Wang等[13]及龔等[14]研究結直腸癌組織與癌旁組織中miR-145的表達情況發現:miR-145在結直腸癌組織中均顯著低表達（均P＜0.01），但表達水平是否與臨床特征有關尚有爭議，而結直腸癌患者血漿中miR-145的表達情況則缺乏相關研究；另外Wang等[13]報道：miR-143只在結腸癌中表達降低，考慮到本研究中大多數研究對象是直腸癌患者（36/53），故選擇了miR-145來研究血漿miRNAs作為結直腸癌非侵入性標記物的價值。

圖2 結直腸癌患者及健康體檢者血漿中miR-145的RQ（圖中數字代表該組數據中變異較大的標本）

圖3 miR-145的ROC曲線

圖4 不同TNM分期結直腸癌患者和健康體檢者的血漿miR-145的RQ（圖中數字代表該組數據中變異較大的標本）

表1 血漿miR-145的RQ與患者臨床特征之間的關系

miR-145在鼠的心臟中首次被發現[15]，基因編碼位于染色體5q32上，后Michael等[16]證實miR-145基因存在于人類同樣染色體位置，但是人類染色體5q31是一個脆性位點，與染色體5q32相距很近，該位點基因突變或缺失容易導致miR-145的缺失或下調，這可能是導致腺瘤和結直腸癌組織中miR-145表達水平顯著降低的原因之一。其他研究[17]發現，miR-145不僅在多種腫瘤組織中下調，還在多種腫瘤細胞株中下調，且對腫瘤細胞的擴增、侵襲及轉移有抑制作用。但是miR-145在各種腫瘤患者的體液（包括血液、尿液、胸腹水、唾液等）中的研究仍然缺乏，這將是今后研究的新領域。本研究中，miR-145在結直腸癌患者血漿中表達量相比健康對照組顯著降低，兩者差異有統計學意義，但是其表達水平與臨床特征如性別、年齡、腫瘤位置、淋巴結狀態、腫瘤TNM分期、局部浸潤深度及血清CEA水平均無相關性，這與Slaby等[12]和Wang等[13]報道miR-145的低表達水平與結直腸癌患者的臨床特征之間無關相符合，提示miR-145可能僅在結直腸癌發生的起始階段發揮作用，但矛盾的是龔文容等[14]報道miR-145的低表達水平與腫瘤的分化程度及遠處轉移或浸潤生長密切相關。這可能與標本量小及標本來源的不同有關。另外有研究表明[18]miR-145對黏蛋白（Mucin-1）的作用減弱或消失將促進腫瘤的生長和轉移。Gregersen等[19]研究發現miR-145能夠通過識別YES基因和轉錄因子STAT1來發揮抑制腫瘤生長的功能。Sachdeva等[20]通過調節抑癌基因p53對miR-145的誘導來發揮對促癌基因c-Myc的抑制作用，從而抑制腫瘤的生長和浸潤。上述研究結果表明miR-145可能通過突變、缺失、調節轉錄因子或致癌基因等機制來發揮腫瘤抑制性miRNAs（ts-miRs）的作用，但是具體機制還有待進一步研究。

糞便隱血試驗、血清CEA檢測及腸鏡仍是目前臨床上發現結直腸癌的常用手段，但腸鏡屬于侵入性操作，其他檢查敏感性及特異性低[21]，致使臨床上結直腸癌的早期檢出率仍然偏低。本研究中ROC曲線分析發現：血漿miR-145的AUC為0.859（95%CI:0.772～0.947），鑒別結直腸癌患者的敏感性為 86.8%、特異性為88.5%，說明血漿miR-145對結直腸癌有較準確的診斷價值，相比腸鏡、組織病理取材等侵入性檢查具有創傷小、取材方便、患者依從性好等優勢，有望用于結直腸癌的早期篩查和術后復發監測。如果進一步研究更大樣本量的miR-145表達水平及臨床意義，結合Ng等[3]和Huang等[4]發現的miR-92a和miR-29a，有望建立結直腸癌的miRNAs聯合診斷模型，使血漿miRNAs成為結直腸癌常規臨床診斷的非侵入性標記物。

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2012-08-30）

（本文編輯：胥昀）

315000 寧波大學醫學院（黃偉，碩士研究生）；寧波市第一醫院腫瘤外科（張樂鳴），重點實驗室（張怡、陳瑩）

張樂鳴，E-mail：zlm.nb@163.com

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the plasma expression of miR-145 in patients with colorectal cancer and its clinical significance. Methods The plasma levels of miR-145 in 53 patients with colorectal cancer and 26 healthy subjects were measured using real-time quantitative PCR.The relationship between miR-145 expression and clinical characteristics of colorectal cancer was analyzed.The diagnostic value of miR-145 for colorectal cancer was evaluated.Results The plasma miR-145 levels were decreased significantly in colorectal cancer patients（P＜0.01）.The AUC (the area under the ROC curve)of miR-145 was 0.859 with a 86.8%sensitivity and 88.5%specificity in discriminating colorectal cancer from normal subjects;however,the expression levels of miR-145 were not associated with the gender,age,tumor location,nodal status,TNM staging,T-classification and CEA levels of patients (P＞0.05). Conclusion A decreased plasma miR-145 levels are detected in patients with colorectal cancer,which suggests miR-145 might be used as a potential tumor-marker for colorectal cancer.