發酵支原體和梨支原體致死性感染小鼠胸腺細胞 Fas/FasL表達與多器官損傷

溫秀姝 沈丹丹 周麗萍

發酵支原體和梨支原體致死性感染小鼠胸腺細胞 Fas/FasL表達與多器官損傷

溫秀姝 沈丹丹 周麗萍

目的 探討發酵支原體（Mf）和梨支原體（Mpi）感染小鼠胸腺細胞Fas/FasL表達與多器官損傷相關性。 方法 55只清潔級ICR小鼠，分實驗組24只（免疫抑制Mf、Mpi感染組）及對照組31只（非免疫抑制Mf感染和NS組）。感染組分別腹腔注射0.3ml Mf和Mpi標準菌株（6×108-9/ml），NS組注入相同量0.9%氯化鈉注射液。計算各組小鼠死亡率，取其血清進行支原體再培養，免疫組化法分析小鼠胸腺細胞Fas/FasL的表達，電鏡觀察死亡小鼠心、肺、肝和腎的超微結構變化。 結果 實驗組小鼠在感染3～5d后100%死亡（24/24），與非免疫抑制Mf感染對照組比較有統計學差異（P＜0.01）。胸腺細胞Fas/FasL高表達與心、肝、肺和腎等多器官損傷相一致。 結論 Mf或Mpi感染小鼠胸腺細胞Fas/FasL高表達與心、肺、肝和腎多器官損傷相關。

發酵支原體 梨支原體 胸腺 多器官損傷 Fas/FasL

Mycoplasma fermentans Mycoplasma pirum Thymus Multiple organ injury Fas/FasL

發酵支原體（Mycoplasma fermentans，Mf）、梨支原體（Mycoplasma pirum，Mpi）因在HIV感染者和AIDS患者體內成功分離而被稱為艾滋病相關支原體。國內外研究[1]表明,此兩種支原體的協同感染可能加速AIDS患者器官衰竭的發生。而多器官功能不全綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）是AIDS患者快速死亡常見原因。

穿通支原體和豬鼻支原體慢性感染能抑制p53基因，激活NF-kB并與ras基因協同促使細胞轉化，與腫瘤的發生、發展相關[2]。然而,Mf（Mpi是Mf的變種）作為新的致死性感染病原體，致病機制與穿通支原體和豬鼻支原體不同。Mf感染后致患者器官暴發性廣泛壞死，最明顯的是肺、肝，脾、淋巴結、腎上腺，心臟和腦。在電鏡下可證實患者器官組織細胞內存在支原體顆粒，采用單克隆抗體免疫組化分析檢出發酵支原體DNA[3]。前期研究中通過動物實驗證實大鼠或孕鼠感染此兩種支原體后3～5d死亡[4-5]，死亡大鼠、孕鼠和仔鼠的心、肝、肺和腎等多器官壞死、空泡化，并在實驗組的鼠肺、或孕鼠肝以及仔鼠的腦組織中電鏡下驗證支原體顆粒。本實驗試圖探討Mf和Mpi感染與胸腺細胞凋亡調控基因Fas/FasL表達的關系以及與心、肝、肺、腎等多器官損傷相關性，為Mf和Mpi的致病機制研究提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 55只6周齡清潔級ICR雌性小鼠（16～20g/只）由溫州醫學院動物中心提供。

1.1.2 標準菌株與實驗試劑 標準菌株Mf（ATCC19989）、Mpi（ATCC25960）；改良的SP4液體培養基和固體培養基，制備見參考文獻[4-5]；環磷酰胺（0.2g/瓶）購自江蘇恒瑞醫藥股份公司（批號10052621）；SP試劑盒、DAB顯色劑和蘇木素購自北京中杉金橋有限公司；兔抗鼠Fas和FasL多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 標準菌株的復蘇 見參考文獻[4-5]。

1.2.2 實驗動物分組及模型的制備 55只ICR小鼠中35只預先免疫抑制[隔日腹腔注射環磷酰胺50mg/（kg· d×5）次制成免疫抑制模型]，分免疫抑制Mf、Mpi感染組各12只，免疫抑制NS對照組11只；另20只非免疫抑制Mf感染組12只，NS對照組8只。動物模型的制備，見參考文獻[4-5]。

1.2.3 死亡率比較 觀察各組小鼠情況，記錄死亡數及時間，比較死亡率。

1.2.4 血清采集再培養 各組死亡小鼠心臟采血，2500rpm離心20min，取上層血清無菌接種于SP4培養基，置于37℃5%CO2培養箱中，每天觀察至顏色變化至黃色（一般3～5d），即為可疑“陽性”。再將培養物接種至固體培養基（肝消化湯瓊脂），置于37℃5%CO2培養箱中孵育48h，若高倍鏡下出現典型“油煎蛋”樣菌落即可確認為支原體再培養陽性。

1.2.5 Fas/FasL凋亡蛋白的檢測 分別取各組死亡小鼠胸腺組織1cm×1cm×1cm，經4%多聚甲醛固定過夜后，按常規方法制成蠟塊，連續切片，片厚4μm。采用SP法進行常規的免疫組化染色，一抗為兔抗鼠Fas多克隆抗體（1∶200）和兔抗鼠FasL多克隆抗體（1∶200），二抗為山羊抗兔IgG，石蠟切片脫蠟至水，免疫組化檢測采用高壓抗原修復及SP染色法，具體操作按試劑盒說明書進行，DAB顯色劑室溫下顯色，蘇木素復染，陰性對照用PBS替代一抗，其余步驟同上。結果判斷：400倍光鏡下觀察以胞質及胞膜被染成棕黃色或棕褐色者為陽性細胞，每張切片隨機選取3～5個代表性視野，用Nikon E-800照相系統拍照保存。應用IPP分析軟件測定切片中陽性蛋白區域的累積光密度值（IOD值）。

1.2.6 電鏡樣本制作及觀察 取各感染組（12h和死亡鼠各1只）胸腺、心、肝、肺和腎組織各0.5cm×0.5cm×0.5cm，置入電鏡固定液，經2.5%戊二醛和1%鋨酸雙重固定，丙酮酸梯度脫水，Epon-812環氧樹脂包埋，RMC-PT超薄切片機切片，超薄切片經鉛-鈾雙重染色，H-7500透射電鏡下觀察并拍片。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件，計量資料用表示。Fisher確切概率法分析死亡率，方差分析和LSD檢驗分析Fas和FasL蛋白的表達。

2 結果

2.1 死亡率比較 Mf和Mpi感染組小鼠均在感染3～5d后死亡 (100%)，非免疫抑制Mf感染組死亡2只(16.7%)，正常NS對照組及免疫抑制NS對照組均無小鼠死亡。Mf和Mpi感染組死亡率與其他3組比較，均有統計學差異（均P＜0.01）。

2.2 血清再培養結果 NS對照組未見支原體菌落，各感染組支原體分離培養均見“油煎蛋”樣陽性菌落，為Mf或Mpi再培養陽性。

2.3 Fas/FasL蛋白免疫組化檢測 Mf感染組Fas蛋白IOD值77 082.40±12 093.40，Mpi感染組為10 5462.95± 23 525.31，較非免疫抑制感染組21 006.39±9 372.51及對照組13 583.04±4756.39明顯升高，均有統計學差異（均P＜0.01）。而Mf或Mpi感染組FasL蛋白IOD值也明顯升高，分別是92 191.71±8 322.01及115 523.42±26 150.27，與非免疫抑制感染組47 013.15±12 332.40及對照組9 965.25±4 723.46比較，也具有統計學差異（均P＜0.01）。Mf和Mpi感染組和對照組Fas/FasL表達（圖1，見插頁）。

2.4 超微結構觀察 感染組小鼠心、肝、肺和腎等多器官廣泛損傷，感染12h后胸腺組織細胞已發生超微結構改變，至死亡時胸腺細胞胞核嚴重固縮，內質網空泡化。感染組細胞Fas和FasL的陽性表達顯著升高提示凋亡加速。并且，胸腺細胞Fas/FasL高表達與胸腺、心、肺、肝和腎等多器官炎癥、壞死損傷相一致（圖2，見插頁）。

3 討論

Fas廣泛表達于胸腺、肺等組織細胞表面，與其相應配體FasL共同介導細胞凋亡。有實驗提示機體在感染、炎癥過程中，免疫細胞表達FasL與細胞表面的Fas結合促使細胞凋亡，而細胞凋亡的同時伴隨著細胞的炎癥與壞死[6]。研究證實，從AIDS患者Kaposi’s Sarcoma中或Mf感染致死的患者中分離的Mf均含有HIV-1的基因片段，此基因片段或許增加Mf的致病性[3]。Nicolson等[3]推測致病性發酵支原體也能像HIV一樣直接侵入免疫系統攻擊靶細胞（免疫細胞），并在細胞內快速增殖，致重要器官（心、肝、肺、腎和腦）組織細胞壞死，導致患者迅速死亡，以上與我們的動物實驗結果完全一致。Lo[7]報道發酵支原體感染猴子后抑制正常的炎癥免疫反應，使抗體反應缺如或產生緩慢，隨之演變為各器官損傷，持續放大和自我破壞的炎癥過程，導致播散性炎癥細胞的活化，最終表現為致命的全身系統性感染，嚴重時是暴發性的。MODS是全身性炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）進行性加重的結果，其最終后果是不可逆轉而快速致死[8-9]。

本實驗中免疫抑制小鼠在感染Mf或Mpi的3～5d內死亡率100%，與非免疫抑制Mf感染對照組（2/12，16.7%）比較有統計學差異。電鏡下提示感染死亡小鼠的胸腺、心、肝、肺、腎等重要器官組織細胞壞死、空泡化，細胞中見3層膜結構的支原體顆粒。尤其是免疫抑制Mpi感染組12h胸腺組織見炎性細胞浸潤，細胞核固縮、變形，線粒體腫大、空泡化等超微結構改變。結果與Lo[7]報道的猴子體內實驗相一致，尤其是感染小鼠胸腺細胞Fas/FasL高表達與多器官損傷一致。此實驗結果為發酵支原體和梨支原體在免疫抑制患者體內致病性研究提供了一定的實驗依據。

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2012-08-14）

（本文編輯：胥昀）

溫州市科技計劃項目（Y20110107）

325000 溫州醫學院附屬第一醫院實驗診斷中心（溫秀姝）；溫州醫學院檢驗醫學院生命科學學院（周麗萍、沈丹丹）

周麗萍，E-mail：zlpzlp19491949@163.com

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate expression of Fas/FasL in thymocytes and its relation with multiple organ damage in mice lethally infected by Mycoplasma fermentans(Mf)and Mycoplasma pirum(Mpi).Methods 55 ICR mice were randomly divided into experimental group (immunosuppression+Mf and Mpi infection,n=24)and control groups(non-immunosuppression+Mf infection,and normal group,n=31).Mice in experiment group were injected intraperitoneally with 0.3ml(6×108-9/ml)Mf or Mpi,the NS group was injected with 0.3ml sterile normal saline.The mortality rate was evaluated and serum samples were taken for cultivation of the mycoplasma.The expression of Fas/FasL in mice thymus was analyzed with immunohistochemistry.The ultrastructural changes of thymus,heart,lung,liver and kidney were observed with electron microscopy.Results The mice in experimental group all died (24/24)within 3-5 days after infection.The expression of Fas/FasL in thymocytes was high,which was consistent with the extent of damage in the heart,liver,lung and kidney. Conclusion The high expression of Fas/FasL in thymocytes is correlated with the multi-organ damage in Mf and Mpi infected mice.