胃腺癌組織中緊密連接蛋白7和緊密連接蛋白18及E鈣黏素的表達及其意義

楊士賢，吳鐵鏞，劉曉剛

緊密連接蛋白(claudins)是細胞間緊密連接的重要組成部分，其組成及結構的完整性對細胞的穩定有重要作用。緊密連接蛋白7(claudin-7)和緊密連接蛋白18(claudin-18)是claudins家族中具有代表性的成員，這兩者的異常表達在腫瘤進展過程中起重要作用[1]。claudin-7和claudin-18的表達可能與E鈣黏素(E-cadherin)有一定關系并共同促進腫瘤的發生發展。本研究旨在探討claudin-7、claudin-18和E-cadherin在胃腺癌組織中的表達及其意義，為腫瘤生物學研究提供參考。

1　材料與方法

1.1材料收集選擇我院2005年收治的胃腺癌患者81例，其中男49例，女32例；年齡45～78歲，平均59.9歲；胃腺癌診斷均符合世界衛生組織(WHO)消化系統腫瘤病理學與遺傳學診斷標準，術前均未進行放、化療；收集其手術切除后存檔的腺癌蠟塊組織為觀察組。選擇同期在我院進行胃鏡檢查正常者70例，其中男40例，女30例；年齡46～77歲，平均58.7歲；收集其胃體正常黏膜組織為對照組。

1.2檢測方法采用免疫組織化學法檢測claudin-7、claudin-18和E-cadherin水平，濃縮液均購自武漢博士德生物技術有限責任公司，均按比例稀釋后應用。檢測步驟：(1)5 μm切片脫蠟水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，3 min/次。(2)檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復及乙二胺四乙酸(EDTA)抗原熱修復。(3)每張切片滴加1滴過氧化物阻斷溶液(試劑A)，阻斷內源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育10 min。(4)PBS沖洗3次，3 min/次。(5)甩去PBS，每張切片滴加1滴非免疫性動物血清(試劑B)，室溫下孵育10 min。(6)甩去血清，每張切片滴加1滴第一抗體，室溫下孵育60 min或4 ℃過夜。(7)PBS沖洗3次，3 min/次。(8)甩去PBS，每張切片滴加1滴生物素標記的第二抗體(試劑C)，室溫下孵育10 min。(9)PBS沖洗3次，3 min/次。(10)甩去PBS，每張切片滴加1滴鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10 min。PBS沖洗3次，3 min/次，甩去PBS，每張切片滴加2滴新鮮配制的二氨基聯苯胺(DAB)溶液。顯微鏡下觀察3～10 min，陽性顯色為棕色。自來水沖洗，蘇木素復染，0.1%鹽酸分化，PBS沖洗返藍。切片經梯度乙醇脫水干燥，中性樹膠封固。

1.3陽性結果判斷標準claudin-7和claudin-18均定位于細胞質，以細胞質出現棕黃色顆粒為陽性；E-cadherin定位于細胞膜，以細胞膜出現連續的棕黃色顆粒為陽性。隨機選擇10個腫瘤細胞集中的高倍視野，計算陽性細胞占整個視野內細胞總數的百分比，取平均值，以陽性細胞計數≥25%為陽性，<25%為陰性。

1.4觀察內容(1)兩組claudin-7、claudin-18和E-cadherin陽性表達率；(2)claudin-7、claudin-18和E-cadherin陽性表達率與胃腺癌患者臨床特征的關系；(3)claudin-7、claudin-18和E-cadherin之間的相關性；(4)隨訪并計算觀察組患者5年生存率。

1.5統計學方法應用Excel軟件進行數據整理，SPSS 13.0軟件進行統計分析。計數資料以百分數表示，采用χ2檢驗；claudin-7、claudin-18和E-cadherin之間的關系采用線性相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1兩組claudin-7、claudin-18和E-cadherin陽性表達率比較兩組claudin-7、claudin-18和E-cadherin陽性表達率比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見圖1～6，見表1)。

表1兩組claudin-7、claudin-18和E-cadherin陽性表達率比較〔n(%)〕

Table1Comparison of the positive rate of claudin-7，claudin-18 and E-cadherin between two groups

組別例數claudin-7claudin-18E-cadherin對照組7053(89.33)45(64.29)40(57.14)觀察組8121(25.93)27(33.33)18(22.22)χ2值55.944014.420819.3559P值<0.00010.0001<0.0001

注：claudin-7=緊密連接蛋白7，claudin-18=緊密連接蛋白18，E-cadherin=E鈣黏素

2.2claudin-7、claudin-18和E-cadherin陽性表達率與胃腺癌患者臨床特征的關系claudin-7、claudin-18和E-cadherin陽性表達率在不同腫瘤分化程度、有無淋巴結轉移及不同增殖細胞核抗原(PCNA)表達的胃腺癌患者中比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，在不同年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤臨床分期的胃腺癌患者中比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表2)。

2.3claudin-7、claudin-18和E-cadherin的相關性胃腺癌組織中claudin-7與claudin-18(r=0.43，P=0.0342)、claudin-18與E-cadherin(r=0.45，P=0.0461)、claudin-7與E-cadherin(r=0.40，P=0.0279)均呈正相關。

圖1claudin-7在胃腺癌組織中呈陰性表達(×400)圖2claudin-7在胃體正常黏膜組織中呈陽性表達(×400)

Figure1The negative expression of claudin-7 in gastric adenocarcinomaFigure2The positive expression of claudin-7 in normal gastric tissue

圖3claudin-18在胃腺癌組織呈陰性表達(×400)圖4claudin-18在胃體正常黏膜組織中呈陽性表達(×400)

Figure3The negative expression of claudin-18 in gastric adenocarcinomaFigure4The positive expression of claudin-18 in normal gastric tissue

圖5E-cadherin在胃腺癌組織中呈陰性表達(×400)圖6E-cadherin在胃體正常黏膜組織中呈陽性表達(×400)

Figure5The negative expression of E-cadherin in gastric adenocarcinomaFigure6The positive expression of E-cadherin in normal gastric tissue

表2claudin-7、claudin-18和E-cadherin陽性表達率與胃腺癌患者臨床特征的關系〔n(%)〕

Table2Relationship between the positive rate of claudin-7，claudin-18,E-cadherin and different clinical characteristic of gastric adenocarcinoma patients

例數claudin-7χ2值P值claudin-18χ2值P值E-cadherinχ2值P值年齡(歲)0.11570.73370.22500.63530.28930.5907 <553610(27.78)11(30.56)7(19.44) ≥554511(24.44)16(35.56)11(24.44)性別0.78080.37690.10330.74790.23620.6270 男4911(22.45)17(34.69)10(20.41) 女3210(31.25)10(31.25)8(25.00)腫瘤直徑(cm)1.44500.22930.39510.52960.00350.9526 <44113(31.71)15(36.59)9(21.95) ≥4408(20.00)12(30.00)9(22.50)腫瘤臨床分期2.90210.08850.22250.63710.50860.4757 Ⅰ+Ⅱ3914(35.90)14(35.90)10(25.64) Ⅲ+Ⅳ428(19.05)13(30.95)8(19.05)腫瘤分化程度6.74480.00944.93040.02644.15420.0415 高+中4617(36.96)20(43.48)14(30.43) 低354(11.43)7(20.00)4(11.43)淋巴結轉移7.41740.00658.91490.00284.32160.0376 無4116(50.98)20(48.78)13(31.71) 有405(12.50)7(17.50)5(12.50)PCNA(%)6.07640.01379.91430.00165.66530.0173 <254316(37.21)21(48.84)14(32.56) ≥25385(13.16)6(15.79)4(10.53)

注：PCNA=增殖細胞核抗原

2.4觀察組患者5年生存率觀察組患者均獲得隨訪，隨訪時間8～60個月，平均33.1個月。觀察組患者5年生存率claudin-7陽性表達者(14/21，66.67%)與陰性表達者(3/60，5.00%)比較、claudin-18陽性表達者(16/27，59.26%)與陰性表達者(1/54，1.85%)比較、E-cadherin陽性表達者(14/18，77.78%)與陰性表達者(3/63，4.69%)比較，差異均有統計學意義(χ2值分別為24.5880、14.7868和13.2048，P均<0.05)。

3　討論

胃腺癌是消化系統腫瘤中最常見的腫瘤之一，其發病機制較為復雜，細胞外基質和黏附作用的改變在腫瘤的發生發展過程中起重要作用[2-3]。生理情況下，上皮細胞以嚴密監控細胞層的形態存在，在這樣的內環境中，生長和活動被可溶性生長因子組成的網絡嚴密監控并由細胞間緊密連接、細胞基質及其間的空隙傳遞相關信息[4]，包括claudins的作用和鈣黏素(cadherin)的黏附作用。claudins是一組多基因家族蛋白質，在大鼠和人類中至少有24位成員，分子量為22～27 kDa，含有4個跨膜結構域、2個細胞外環形結構及位于胞質中的N末端及C末端結構域[5-6]。相鄰細胞膜中的細胞外環可以相互作用，封閉細胞間隙，對細胞間形成離子通透的選擇性具有重要作用。claudin-7和claudin-18是claudins家族中的重要成員，可能是潛在的腫瘤抑制劑，尤其是對腫瘤細胞轉移的抑制作用。E-cadherin是最重要的黏附物質，也是cadherin家族的一個經典成員[7-9]。目前研究認為，claudin-7、claudin-18和E-cadherin可能在腫瘤的發生發展過程中具有內在聯系[10-11]。

本研究應用免疫組織化學技術檢測胃腺癌患者癌組織中claudin-7、claudin-18和E-cadherin的表達，結果顯示，3者陽性表達率均低于胃體正常黏膜組織，且與患者腫瘤分化程度、淋巴結轉移及PCNA表達相關。表明claudin-7、claudin-18和E-cadherin在胃腺癌的發生發展過程中起重要作用，且與腫瘤的分化、轉移及增殖有關，分析原因為：在腫瘤轉移過程中，原發部位的腫瘤細胞脫落引起脈管轉移并累及淋巴結，細胞間黏附力減弱和細胞連接的松動是重要的始動因素。線性相關分析顯示，胃腺癌組織中claudin-7、claudin-18和E-cadherin之間均呈正相關，提示三者具有協同作用，可能通過內在的位點共同調節細胞間連接的改變。有學者認為E-cadherin是腫瘤細胞浸潤轉移的抑制劑，即其表達水平升高，腫瘤細胞的浸潤、轉移能力下降，而在此過程中，claudins可能對E-cadherin有重要的調節作用，可引起細胞間結構和功能的改變[12]。通過比較claudin-7、claudin-18和E-cadherin陽性表達者與陰性表達者5年生存率發現，claudin-7、claudin-18和E-cadherin的表達均與胃腺癌患者預后相關，聯合檢測claudin-7、claudin-18和E-cadherin的表達有助于判斷患者預后，即claudin-7、claudin-18和E-cadherin同時低表達的患者預后較差。

1李銳，張道榮，蔡存偉，等.Claudin-7與Slug在肺鱗癌和腺癌中表達及其臨床意義[J].中國肺癌雜志，2011，14(6)：492-494.

2劉愛東，龐久玲，劉士生.胃癌中基質金屬蛋白酶-9和CD105表達關系的研究[J].中國老年學雜志，2009，29(7)：886-887.

3許文集，莊瑛瑛，陳玉麗，等.Paxillin在胃腺癌和癌前期變化中的表達及意義[J].中國全科醫學，2011，14(6)：2000.

4Szasz AM，Tokes AM，Micsinai M，et al.Prognostic significance of claudin expression changes in breast cancer with regional lymph node metastasis[J].Clin Exp Metastasis，2011，28(1)：55-63.

5曹云新，張松，楊安鋼.Claudin18在胰腺癌細胞中的表達[J].細胞與分子免疫學雜志，2009，25(12)：1202-1204.

6周雯，王青松.緊密連接蛋白claudin-10基因5′調控區序列的生物信息學分析[J].海南醫學院學報，2010，16(7)：820-823.

7劉愛東，劉士生，許志萍，等.E-Cadherin在胃癌中的表達及意義[J].廣東醫學，2007，28(11)：1806-1807.

8Dong C，Wu Y，Yao J，et al.G9a interacts with Snail and is critical for Snail-mediated E-cadherin repression in human breast cancer[J].J Clin Invest，2012，122(4)：1469-1486.

9袁波，賀紅焰，王明勇,等.血管緊張素-(1-7)對血管緊張素Ⅱ誘導的腎小管上皮細胞E-cadherin、α-SMA表達的影響[J].疑難病雜志，2011，10(5)：366.

10王若騰，胡潔，白亮.Clauudin-7與E-cadherin在肝癌中的表達及相關性[J].中國現代醫生，2011，49(16)：138-140.

11Ramos-Vara JA，Miller MA，Gilbreath E，et al.Immunohistochemical detection of CD34，E-cadherin，claudin-1，glucose transporter 1，laminin，and protein gene product 9.5 in 28 canine and 8 feline meningiomas[J].Vet Pathol，2010，47(4)：725-737.

12韓鳳艷，劉愛東.喉鱗癌中claudin-1、MMP-2和E-cadherin的表達及意義[J].中國誤診學雜志，2010，10(7)：1544-1545.