17-烯丙氨基格爾德霉素對人乳腺癌細胞基質金屬蛋白酶表達調控作用的研究

許 倩，肖麗君，趙恩宏,魏憲嘉，張海燕,趙 爽，鄭 鑫

乳腺癌從早期即表現為全身性疾病，可發生血行播散，近年有關乳腺癌侵襲、轉移的靶向治療成為重要課題。熱休克蛋白90 (heat shock protein 90,HSP90)是一種重要的分子伴侶，可與乳腺癌細胞中的一些信號分子和激酶結合形成復合物，從而參與調控乳腺癌的侵襲轉移能力[1]。乳腺癌細胞對藥物破壞HSP90功能顯示高度的敏感性，HSP90成為乳腺癌細胞內藥物作用的理想靶點。17-烯丙氨基格爾德霉素(17-allylamino-17-demethoxy geldanamycin，17-AAG)作為一種新的HSP90抑制劑，因其獨特的作用靶點和高效的抗腫瘤活性及對機體的低毒性近年來備受關注。17-AAG抗乳腺癌作用顯著，目前已在進行Ⅱ期臨床實驗[2]。17-AAG有抗乳腺癌侵襲作用，但缺乏深入研究。本研究以高轉移乳腺癌細胞系MCF-7為研究對象，觀察了17-AAG對MCF-7細胞基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達的影響，試圖探尋17-AAG對乳腺癌侵襲、轉移的干預作用，并明確17-AAG對MMP-2、MMP-9表達調控的抑制作用是其抗侵襲、轉移的重要機制之一。為17-AAG在乳腺癌治療中的開發和應用提供實驗和理論依據，為相關抗腫瘤藥物的開發提供新思路。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞來源人乳腺癌MCF-7細胞系由承德醫學院附屬醫院中心實驗室惠贈。

1.1.2試劑17-AAG(深圳生爾易美有限公司)；胎牛血清(杭州四季青生物制劑公司)；DMEM培養基、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、瓊脂糖(美國Gibco公司)；Trizol總RNA提取試劑(美國Invitrogen 公司)；反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒(大連寶生物公司)；引物及內參(上海生工)；MMP-2、MMP-9、β-actin單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根酶標記羊抗兔和羊抗鼠IgG(美國KPL公司)；ECL超敏發光液(北京普利萊公司)；DNA Marker(大連寶生物公司)。

1.1.3儀器090-135.001倒置顯微鏡(德國Leica公司)；Sorvall/Biofuge fresco高速冷凍離心機(德國Heraeus公司)；150培養箱(德國Heraeus公司)；MK3酶標儀(芬蘭雷勃公司)；Icycler PCR儀(美國Bio-Rad公司)；96、6孔細胞培養板(美國Corning公司)。

1.2實驗方法

1.2.1四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT法)檢測17-AAG對MCF-7細胞增殖的影響

1.2.1.1MCF-7細胞的增殖培養取對數生長期的MCF-7細胞置于96孔板中培養，細胞初始濃度為5×104/ml，190 μl/孔，然后置37 ℃ 5%二氧化碳(CO2)培養箱培養至70%融合，加入不同終濃度的17-AAG，其濃度分別為10.000、5.000、2.500、1.250、0.625、0.310、0.165 mg/L；每1個濃度設4個平行孔，共溫育48 h。同時設立不加藥物的空白對照組，繼續培養24 h和48 h。

1.2.1.2MTT法檢測MCF-7細胞的增殖終止培養前4 h每孔加入5 g/L的MTT溶液，每孔10 μl，輕振幾下培養板，再放回培養箱，培養4 h，然后吸凈上清液。加入二甲基亞砜150 μl/孔，振蕩60 min，使紫藍色結晶完全溶解。混勻后，在酶標儀上檢測492 nm波長處的A值。計算17-AAG對腫瘤細胞的生長抑制率=(1-A對照組)/A實驗組×100%。以同一樣品的不同濃度對腫瘤細胞的抑制率作圖得到劑量反應曲線，計算半數抑制濃度(IC50)。

1.2.2RT-PCR法檢測17-AAG作用后MCF-7細胞MMP-2、MMP-9 mRNA的表達

1.2.2.1MCF-7 細胞總RNA的提取取對數生長期細胞，0.25%胰酶消化，制成單細胞懸液，調整細胞濃度為5×104/ml，加入至6孔板，37 ℃、5%CO2培養箱中至70%融合后，加入17-AAG(終濃度：1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L)，每個濃度設5個復孔，同時設立對照組(不加藥組)。終止培養后，按照試劑操作流程進行RNA提取，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示28 S和18 S 2條完整的條帶，28 S條帶亮度是18 S的2倍；紫外分光光度計測A值，A260/A280比值在1.8～2.0，說明RNA純度較高，而且比較完整。

1.2.2.2RT-PCR法檢測MMP-2、MMP-9 mRNA的表達按照RT-PCR試劑盒進行具體操作。MMP-2基因上游引物：5′-GCTTGGCTTCAATCAAAGAGT-3′，下游引物：5′-TGCGAGGGAAGAAGTTGTAGTT-3′，擴增產物345 bp；MMP-9基因上游引物:5′-TCGTGCCTCTGCCCATAGG-3′，下游引物:5′-CACCCTTGTGCTCTTCCCTG-3′，擴增產物：462 bp；內參照β-actin基因上游引物：5′-AGCGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物：5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′，擴增產物:453 bp。cDNA的合成：30 ℃、10 min，42 ℃、30 min，99 ℃、5 min，5 ℃、5 min。PCR擴增MMP-2：94 ℃、2 min，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、45 s，30個循環；PCR擴增MMP-9：94 ℃、2 min，94 ℃、30 s，57 ℃、30 s，72 ℃、1 min，28個循環；PCR擴增內參照β-actin：94 ℃、2 min，94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、1 min，28個循環。將產物于2%瓊脂糖凝膠電泳，恒壓120 V，30 min，UVP成像分析系統拍照觀察。圖片掃描圖像用Quantity One 軟件進行灰度分析，計算目的基因條帶與內參照β-actin的灰度比值。

1.2.3蛋白印跡(Western Blotting)法檢測17-AAG作用后乳腺癌MCF-7細胞MMP-2、MMP-9的表達

1.2.3.1總蛋白的提取體外培養細胞至對數生長期，貼壁細胞用0.25%胰酶消化后，制成單細胞懸液，計數，離心，調整細胞濃度為5×104/ml，加入到6孔板，37 ℃ 5%CO2培養箱中，培養至70%融合，之后分別加入17-AAG，使其終濃度為1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L，每個濃度設5個復孔，同時設立對照組(不加藥組)。48 h后終止培養，溫和磷酸鹽緩沖液洗細胞2次，加入冰預冷的適量細胞裂解液，冰上裂解20 min，4 ℃，12 000 r/min，離心半徑8.5 cm，離心20 min，收集上清液，按照BCA蛋白定量試劑盒說明進行定量。

1.2.3.2取50 μg蛋白與5×SDS加樣緩沖液混合，100 ℃變性5 min，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉移至PVDF膜上，以含5%脫脂奶粉TBS-T溶液〔10 mmol/L Tris-鹽酸,100 mmol/L氯化鈉(NaCl)+0.1%吐溫20〕封閉，室溫下與兔抗人MMP-2、MMP-9單克隆抗體(1∶300稀釋)共同孵育，再與相應的HR-PO抗Ig抗體耦聯物(1∶2 000稀釋)孵育，以上步驟間用TBS-T常溫下充分洗膜。ECL檢測試劑盒顯影，洗片。同樣方法，以β-actin(1∶100稀釋)雜交作為內參照。膠片經掃描儀掃描后獲得圖像，用Quantity One分析軟件測定條帶灰度值，計算MMP-2、MMP-9的相對含量，即MMP-2或MMP-9條帶灰度值/內參照β-actin條帶灰度值。

2　結果

2.117-AAG對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響10.000、5.000、2.500、1.250、0.625、0.310、0.165 mg/L 17-AAG及空白對照組培養24 h和48 h時A值比較，差異均有統計學意義(F值分別為39.41和61.56，P<0.05，見表1)。體外作用24 h后IC50均值為34.61，體外作用48 h的IC50均值為6.22。

2.2不同濃度17-AAG對MCF-7細胞MMP-2、MMP-9 mRNA表達的影響對照組及1.00 mg/L組、2.00 mg/L組、3.00 mg/L組、5.00 mg/L組MMP-2/β-actin和MMP-9/β-actin比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中各組間兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表2、圖1)。

表1不同濃度17-AAG培養24 h和48 h對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響比較

Table1Comparison of inhibitory effects of different concentrations of 17-AAG to human mammary cancer MCF-7 cells

17-AAG濃度(mg/L)24h A值(x±s) 抑制率(%)48h A值(x±s) 抑制率(%)10.0000.46±0.0237.690.40±0.0865.60 5.000 0.56±0.0324.150.50±0.0657.40 2.500 0.59±0.0121.150.53±0.0457.20 1.250 0.60±0.0417.850.55±0.0656.80 0.625 0.61±0.0216.010.59±0.0656.67 0.310 0.64±0.0112.680.63±0.0553.78 0.165 0.68±0.036.710.65±0.0553.03空白對照組0.73±0.03-1.17±0.08-

圖1不同濃度17-AAG對MCF-7細胞MMP-2、MMP-9 mRNA表達的影響

Figure1Effects of 17-AAG on the mRNA expression of MMP-2 and MMP-9 in MCF-7 cells with different concentrations

2.3不同濃度17-AAG對MCF-7細胞MMP-2、MMP-9表達的影響對照組及1.00 mg/L組、2.00 mg/L組、3.00 mg/L組、5.00 mg/L組MMP-2/β-actin和MMP-9/β-actin表達量比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中各組間兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表3、圖2)。

Table2Effects of 17-AAG on the mRNA expression of MMP-2 and MMP-9 in MCF-7 cells with different concentrations

組別例數MMP-2/β-actin MMP-9/β-actin 對照組50.90±0.05 0.98±0.03 1.0mg/L組50.74±0.06△ 0.80±0.04△ 2.0mg/L組50.49±0.03△▲ 0.56±0.04△▲ 3.0mg/L組50.35±0.03△▲☆ 0.37±0.03△▲☆ 5.0mg/L組50.17±0.04△▲☆■0.26±0.03△▲☆■F值228.47368.59P值<0.05<0.05

注：與對照組比較，△P<0.05；與1.0 mg/L組比較，▲P<0.05；與2.0 mg/L組比較，☆P<0.05；與3.0 mg/L組比較，■P<0.05

Table3Effects of 17-AAG on the proteins expression of MMP-2 and MMP-9 in MCF-7 cells with different concentrations

組別例數MMP-2/β-actinMMP-9/β-actin對照組51.01±0.06 1.00±0.09 1.0mg/L組50.86±0.07△ 0.84±0.03△ 2.0mg/L組50.63±0.05△▲ 0.57±0.03△▲ 3.0mg/L組50.54±0.06△▲☆ 0.46±0.03△▲☆ 5.0mg/L組50.41±0.04△▲☆■0.30±0.05△▲☆■F值96.47145.15P值<0.05<0.05

注：與對照組比較，△P<0.05；與1.0 mg/L組比較，▲P<0.05；與2.0 mg/L組比較，☆P<0.05；與3.0 mg/L組比較，■P<0.05

圖2不同濃度17-AAG對MCF-7細胞MMP-2、MMP-9表達的影響

Figure2Effects of 17-AAG on the proteins expression of MMP-2 and MMP-9 in MCF-7 cells with different concentrations

3　討論

乳腺癌發病率和病死率逐年增加，嚴重威脅著女性健康。25%～30%的早期乳腺癌患者隨訪10～15年后發生遠處轉移，侵襲和轉移是乳腺癌患者死亡的主要原因。抗腫瘤藥物對腫瘤侵襲和轉移的抑制作用成為了一個重要的研究課題。HSP90是一種重要的分子伴侶，研究表明其可與乳腺癌細胞中的多種信號分子和激酶結合形成復合物，從而參與調控乳腺癌的侵襲轉移能力。17-AAG可對HSP90產生強烈的抑制作用，從而通過降解客戶蛋白、誘導腫瘤凋亡、干擾細胞周期等作用抑制腫瘤細胞的生長，近年來備受關注。國內外目前針對17-AAG抗乳腺癌機制的研究主要集中在誘導腫瘤凋亡、干擾細胞周期等方面。由于17-AAG多靶點抗肺瘤作用的特點，新的生物學作用不斷被發現，很多確切機制還有待闡明，如抗侵襲作用雖有報道但缺乏深入研究。

腫瘤細胞侵襲轉移過程中首先必須具備降解細胞外基質(ECM)及基底膜(BM)的功能，進而形成局部溶解區以構成腫瘤細胞移動的通道，而這個降解功能主要由蛋白水解酶完成。MMP是重要的一類蛋白水解酶。近年來研究發現，MMPs通過對ECM、BM的降解作用和增強腫瘤性血管的生成作用而促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[3]。MMPs在人類腫瘤中廣泛而大量表達，大量研究證實MMPs的高水平表達與腫瘤的侵襲和轉移能力以及預后不良有關，并在腫瘤的血管生成中起著決定性作用[4-5]。MMPs活性增加會加速細胞外基質的降解作用，從而促進腫瘤細胞的浸潤和轉移[6-7]。其中最重要的是MMP-2、MMP-9。正常情況下MMP-9的表達很低，其表達主要受位于20號染色體的基因轉錄控制。大量研究表明，許多惡性腫瘤組織及轉移灶中 MMP-9表達明顯增強，實驗中抑制MMP-2活性可使腫瘤體積減少70%，將腫瘤細胞移植入MMP-2或MMP-9基因缺失的大鼠體內，與正常對照組大鼠比較，腫瘤血管生成明顯減少[8]。

抗腫瘤藥物針對MMP-2和MMP-9的負性調控作用而發揮抗侵襲和轉移作用成為了一個重要的研究課題[9-10]。本研究結果顯示，17-AAG對人乳腺癌MCF-7細胞的增殖具有明顯的抑制作用，并能抑制MMP-2和MMP-9的表達。1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L的17-AAG作用48 h后，對MCF-7細胞MMP-2和MMP-9 mRNA及其表達均下調，且具有濃度依賴性。說明17-AAG抑制MMP-2和MMP-9表達水平是其發揮抗腫瘤侵襲轉移作用的重要機制之一。我們進一步的工作將探尋17-AAG是通過什么通路對MMP-2和MMP-9進行調控，這個過程是否還有其他因子參與。將進一步豐富17-AAG抗乳腺癌侵襲的作用機制和作用靶點，為17-AAG在臨床上的進一步開發和應用提供實驗依據。

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2Modi S,Stopeck A,Linden H,et al.HSP90 inhibition is effective in breast cancer:a phase Ⅱ trial of tanespimycin (17-AAG) plus trastuzumab in patients with HER2-positive metastatic breast cancer progressing on trastuzumab[J].Clin Cancer Res,2011,17(15):5132-5139.

3Lubbe WJ,Zhou ZY,Fu W,et al.Tumor epithelial cell matrix metalloproteinase 9 is a target for antimetastatic therapy in colorectal cancer[J].Clin Cancer Res,2006,12(6):1876-1882.

4Lipari L,Mauro A,Gallina S,et al.Expression of gelatinases (MMP-2,MMP-9) and cyclooxygenases (COX-1,COX-2) in some benign salivary gland tumors[J].Int J Immunopathol Pharmacol,2012,25(1):107-115.

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