非小細胞肺癌中缺氧誘導因子1α和環氧化酶2的表達及其與人乳頭狀瘤病毒感染的相關性研究

周 穎，張 輝，趙 敏，謝永紅

缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是氧調節亞基，又是功能亞基，在缺氧條件下HIF-1α具有促進血管形成及影響腫瘤細胞增殖的功能[1]。環氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)是一種誘導型酶，與腫瘤細胞的增殖、抗細胞凋亡、腫瘤血管的生成有關[2]。人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一種DNA病毒，感染人和動物的皮膚或黏膜可引起增殖性損傷。近年來，越來越多的國內外臨床和實驗室研究檢測出肺癌患者攜帶HPV[3-4]，尤其是HPV 16、18型。但HPV感染與肺癌的關系，目前說法不一。有關肺癌中HIF-1α和COX-2與HPV感染的關系報道較少。本研究探討HIF-1α和COX-2在非小細胞肺癌(NSCLC)發生、發展中的作用以及HPV感染與NSCLC的相關性，并初步分析HIF-1α和COX-2與HPV感染的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集秦皇島市第一醫院2012年1—5月NSCLC新鮮癌組織標本60例為NSCLC組，其中男46例，女14例；年齡36～80歲，平均55歲；鱗癌42例，腺癌18例；高分化12例，中分化29例，低分化19例；淋巴結轉移30例，無淋巴結轉移30例；TNM分期：Ⅰ期28例，Ⅱ期26例，Ⅲ期6例；吸煙者43例，不吸煙者17例。另選取同期住院的肺良性病變組織20例為肺良性病變組，其中男13例，女7例；年齡28～80歲，平均42歲；肺結核6例，炎性假瘤5例，硬化性血管瘤4例，肺大皰4例，支氣管擴張1例。標本取材后，置-20 ℃保存，甲醛水溶液固定，石蠟包埋。

1.2 HPV聚合酶鏈式反應(PCR)檢測

1.2.1 引物 選用分別用來擴增HPV 16、18型的特異性引物2對，均由北京奧科生物技術有限責任公司合成。引物序列見表1。

1.2.2 組織DNA的提取 取適量冷存組織，加提取緩沖液制成單細胞懸液后，沸水浴10 min，冷卻至室溫加蛋白酶K消化，酚-氯仿-異戊醇反復抽提3次，再經100%冰冷無水乙醇沉淀、70%冰冷無水乙醇洗滌后，加TE(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)緩沖液溶解，所得DNA在4 ℃保存。

表1 引物序列和產物長度

1.2.3 PCR擴增反應 每25 μl反應體系中包含 10×buffer 2.5 μl，20 pmol/μl引物各0.5 μl，Taq酶1 μl(1 U/μl)，Mg2+1.5 μl，dNTPs 0.5 μl，去離子水16.5 μl及DNA模板2 μl。擴增條件：94 ℃預變性5 min，循環特征為94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共30個循環，72 ℃延伸8 min。每次實驗以不加模板為陰性對照，HPV 16、18型分別用Siha和Hela細胞株DNA作陽性對照。PCR擴增產物用加有溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠，80 V電壓下電泳約40 min，于紫外透射儀上觀察結果。

1.3 HIF-1α、COX-2免疫組化檢測

1.3.1 試劑與方法 HIF-1α抗體、COX-2抗體及通用型SP試劑盒均購自福州邁新生物技術開發有限公司，染色步驟嚴格按試劑盒說明書操作。一抗稀釋濃度為1∶100。陰性對照用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。

1.3.2 判斷標準 HIF-1α陽性表達為細胞核出現棕黃或棕褐色顆粒，COX-2陽性表達為胞質或胞膜出現棕黃或棕褐色顆粒，顯色結果由兩位病理醫生采用半定量評分系統獨立判定。每例均在高倍鏡下(×400)隨機選擇5個視野，每個視野計數200個細胞，計算陽性細胞百分率，取平均值，用半定量積分法判斷結果：0分陰性；1分陽性細胞百分率<25%；2分25%～75%；3分>75%。陽性強度：1分弱表達(淺黃色)；2分中等強度表達(棕黃色)；3分強表達(棕褐色)。兩者積分相乘，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(±)，4～6分為中等陽性(+)，7～9分為強陽性(++)。就其結果進行分析，將-、±合并為陰性，+、++合并為陽性。

1.4 統計學方法 采用SPSS 12.0統計軟件進行統計學分析，計數資料采用χ2檢驗；相關性采用直線相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HIF-1α、COX-2的檢測結果及兩者的相關性 NSCLC中HIF-1α的陽性表達位于細胞核(見圖1)，陽性率為48.3%(29/60)，肺良性病變組未見陽性表達，差異有統計學意義(χ2=15.163,P<0.05)。COX-2的陽性表達位于胞質或胞膜(見圖2)，陽性率為58.3%(35/60)，肺良性病變組未見陽性表達，差異有統計學意義(χ2=20.741,P<0.05)。HIF-1α陽性組中COX-2的陽性率為82.8%(24/29)，高于HIF-1α陰性組的35.5%(11/31)，差異有統計學意義(χ2=13.777,P<0.05)。HIF-1α與COX-2的表達量呈正相關(r=0.479，P<0.05)。

2.2 HPV DNA的PCR檢測結果及與臨床病理特征的關系 HPV DNA檢出率NSCLC組為41.7%(25/60)，肺良性病變組為5.0%(1/20)，差異有統計學意義(χ2=9.193,P<0.05，見圖3)。HPV 16型12例，占48.0%(12/25)；HPV 18型13例，占52.0%(13/25)，差異無統計學意義(χ2=0.003,P=0.957)。NSCLC組HPV感染與性別、年齡、是否吸煙、組織學分型無關，而與分化程度及有無淋巴結轉移相關(P<0.05，見表2)。

2.3 HIF-1α、COX-2的表達與HPV感染的關系 HPV DNA陽性組與陰性組HIF-1α的陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；HPV DNA陽性組與陰性組COX-2的陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表3)。

表2 NSCLC患者HPV感染與臨床病理特征的關系〔n(%)〕

Table2 Relationship between HPV infection and clinicopathological features of NSCLC

臨床病理特征例數HPVDNA陽性 陰性χ2值P值性別0.0110.918 男4619(41.3)27(58.7) 女146(42.9)8(57.1)年齡(歲)0.0230.880 <50156(40.0)9(60.0) ≥504519(42.2)26(57.8)吸煙0.0020.961 是4318(41.9)25(58.1) 否177(41.2)10(58.8)組織學分型0.0820.775 鱗癌4218(42.9)24(57.1) 腺癌187(38.9)11(61.1)分化程度6.8570.009 高分化121(8.3)11(91.7) 中、低分化4824(50.0)24(50.0)淋巴結轉移8.2970.004 有3018(60.0)12(40.0) 無307(23.3)23(76.7)

表3 NSCLC患者HPV感染與HIF-1α、COX-2表達的關系

Table3 Relationship between HPV infection and HIF-1α,COX-2 expression in NSCLC

HPVDNA例數HIF-1α陽性 陽性率(%) χ2值 P值COX-2陽性 陽性率(%) χ2值 P值陽性組251352.00.2300.6311560.00.0490.825陰性組351645.72057.1

3 討論

HIF-1是由α、β亞單位構成的異二聚體，其中HIF-1α受缺氧的調節。在細胞缺氧時，細胞核中HIF-1α顯著增加。HIF-1α不僅調節眾多的下游基因以維持或促進腫瘤的血管形成和腫瘤的發展，而且可反饋性接受腫瘤生長過程中產生的因子或缺氧環境的調節表達上調，如此形成惡性循環，促進腫瘤生長、浸潤和轉移[5-6]。本研究中，HIF-1α在NSCLC中的陽性率為48.3%，肺良性病變組未見HIF-1α表達，提示HIF-1α在NSCLC的發生、發展中起重要作用[7]。

M：Marker；1、2：HPV 16陽性、陰性對照；3、4：HPV 16；5、6：HPV 18陽性、陰性對照；7、8：HPV 18

圖3 PCR檢測HPV 16、18型DNA擴增結果電泳圖

Figure3 Electrophoretogram of HPV type 16/18 DNA detected by PCR

COX-2是催化前列腺素合成的限速酶，在正常組織中基本不表達，但在許多病理生理環境下通過生長因子、炎癥刺激、癌基因及腫瘤啟動子等作用表達上調，并促進腫瘤的發生[8]。COX-2在促進腫瘤新生血管生成、刺激腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤細胞凋亡和機體的免疫反應、參與前致癌物的活化、促進腫瘤的浸潤和轉移方面起著重要作用[9]。HIF-1α和COX-2共同的靶基因為血管內皮生長因子(VEGF)，兩者可能通過這一下游路徑促進腫瘤的生長和血管的形成。有研究表明COX-2可通過催化其產物前列腺素E2(PGE2)激活HIF-1α活性，通過COX-2/PGE2/HIF-1α/ VEGF途徑促進腫瘤血管生成[10]。但也有研究認為，COX-2也是HIF-1α的靶基因之一，受缺氧的誘導活化。兩者可能的聯系為缺氧誘導HIF-1α的表達，HIF-1α通過與COX-2啟動子中的缺氧反應元件結合，激活COX-2的轉錄，而COX-2可以通過其代謝產物PGE2等反作用于HIF-1α，使HIF-1α活性增加，在核內的積聚增加，翻譯轉錄加速，從而形成一個正反饋網絡。本研究發現NSCLC中HIF-1α和COX-2表達呈正相關，提示HIF-1α與COX-2的表達在NSCLC的發生發展中具有協同作用。

HPV感染是宮頸癌的主要病因，然而近年來HPV感染與肺癌的關系已經引起人們的重視[11]。本研究結果顯示HPV DNA檢出率NSCLC組為41.7%，明顯高于肺良性病變組的5.0%，提示HPV感染與NSCLC相關聯，且隨著腫瘤分化程度的降低而增高，并與淋巴結轉移相關。

HIF-1α與HPV感染之間的關系國內外研究較少，其可能的聯系有：野生型P53蛋白可通過直接抑制HIF-1α的轉錄活性和通過促進mdm2介導的HIF-1α泛素化-蛋白酶降解兩種形式抑制HIF-1α活性；而HPV 16、18型E6可以通過降解野生型P53蛋白[12]，從而促進HIF-1α的積聚。但本研究未發現兩者有相關性。目前對COX-2與HPV感染之間的關系認識較少，有研究認為，HPV感染致炎癥發生，產生大量炎性因子，激活COX-2，炎性細胞表達COX-2，再通過旁分泌機制和信號轉導引起黏膜損傷，致使其易受HPV感染[13]。然而本研究發現NSCLC中COX-2表達與HPV感染無協同作用。

綜上所述，HIF-1α與 COX-2在NSCLC的發生、發展中具有重要作用。采用藥物或應用RNA干擾技術抑制HIF-1α基因的表達以及針對COX-2的靶向治療將為NSCLC的預防和治療開辟新的途徑。

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