外源性一氧化碳對游離脂肪酸刺激巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用

王金保，謝建新，王鐵鵬，徐文靜，馮曉朋，王婷婷，張 君

有研究表明，肥胖是一種慢性低炎癥狀態(tài)，各種炎性因子通過激活JNK1而導(dǎo)致各組織器官發(fā)生胰島素抵抗[1]。在肥胖狀態(tài)下，脂肪細(xì)胞釋放過量飽和脂肪酸,通過TLR(toll-like receptor)4/NF-κB信號通路激活巨噬細(xì)胞；巨噬細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子(TNF)-α反作用于脂肪細(xì)胞，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)并促進(jìn)游離脂肪酸(FFA)的進(jìn)一步釋放。高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織TLR1-9和TLR11-13表達(dá)升高，受體下游信號通路分子以及細(xì)胞因子〔TNF-α、白介素(IL)-6、干擾素(IFN)α/β、IL-12等〕的表達(dá)水平也有顯著升高[2]。

研究發(fā)現(xiàn)，一氧化碳(CO)是一種細(xì)胞保護(hù)分子[3]。體內(nèi)CO的來源有兩種,一種是外源性CO,即吸入氣體中含有的少量CO；另一種是內(nèi)源性CO，機(jī)體內(nèi)生成的CO。內(nèi)源性CO主要來源于血紅素氧合酶1(HO-1)催化血紅素生成膽綠素、CO、Fe2+[4]的過程，正常情況下占75%。而一氧化碳釋放分子2(CORM-2)是一種特殊的CO攜帶者，可作為外源性CO供體，在溶液中可以實(shí)現(xiàn)持續(xù)、緩慢釋放CO的效果。最近研究提示CO/HO-1具有抗炎作用[5]，本研究利用巨噬細(xì)胞模型，研究CO抑制炎性反應(yīng)的分子機(jī)制，探討CO對肥胖狀態(tài)炎性反應(yīng)的作用，為臨床代謝綜合征的防治提供新的基礎(chǔ)理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)觀察 RAW264.7巨噬細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化、傳代，當(dāng)細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶70%～80%時，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 細(xì)胞分組及樣本收集 取狀態(tài)良好的巨噬細(xì)胞，分為空白對照組、FFA組和CORM-2組。空白對照組加無酚紅無雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基；FFA組將棕櫚酸(PA)溶于100%異丙醇，加入無酚紅無雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基中,使FFA工作濃度為100 μmol/L，作用于巨噬細(xì)胞24 h；CORM-2組將CORM-2溶于DMSO中，加入無酚紅無雙抗的高糖DMEM使胰島素工作濃度為100 μmol /L，作用于巨噬細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞蛋白及上清-80 ℃保存。

1.2 研究方法

1.2.1 Western-blot法檢測p-NF-κB的表達(dá) 取10 μl細(xì)胞總蛋白于10%SDS PAGE 凝膠中電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含5% BSA的TBST封閉2 h后，膜浸入1∶1 000稀釋的一抗工作液中，4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜30 min后加入1∶20 000稀釋的二抗工作液，室溫孵育2 h，TBST洗膜30 min后加入發(fā)光試劑溶液，暗室曝光，壓X線片2～10 min，顯影，定影。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測TNF-α和IL-6的表達(dá) 取細(xì)胞上清，嚴(yán)格按照說明書操作，用酶標(biāo)儀450 nm檢測各孔吸光度，采用ELISA分析軟件和標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果，據(jù)各組的吸光度值計算TNF-α與IL-6水平。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞形態(tài) 巨噬細(xì)胞呈圓形，少數(shù)細(xì)胞呈不規(guī)則形，分布均勻(見圖1)。

2.2 p-NF-κB水平比較 Western-blot法結(jié)果顯示，F(xiàn)FA組p-NF-κB表達(dá)水平明顯高于空白對照組，CORM-2組p-NF-κB表達(dá)水平明顯低于FFA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q=-27.631、20.083，P<0.05，見圖2、表1)。

注：A為×200，B為×400

圖1 RAW264.7巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前形態(tài)

Figure1 The form prior to experiment of RAW264.7 macrophages

圖2 Western blot結(jié)果顯示的各組p-NF-κB表達(dá)水平

Figure2 Expression of p-NF-κB,protein detected by Western-blot

2.3 TNF-α與IL-6水平比較

2.3.1 TNF-α測定 FFA組TNF-α水平明顯高于空白對照組，CORM-2組TNF-α水平明顯低于FFA組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(q=-14.05、10.926，P<0.05，見表1)。

2.3.2 IL-6測定 FFA組IL-6水平較空白對照組明顯升高，CORM-2組IL-6水平較FFA組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q=-17.151、12.235，P<0.05，見表1)。

表1 3組巨噬細(xì)胞p-NF-κB，TNF-α及IL-6表達(dá)水平比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與FFA組比較，△P<0.05;TNF-α=腫瘤壞死因子α，IL-6=白介素6

3 討論

本研究結(jié)果提示，F(xiàn)FA刺激巨噬細(xì)胞后，p-NF-κB被激活，分泌的TNF-α及IL-6水平升高；而用CORM-2干預(yù)后這些指標(biāo)的水平均明顯下降，提示CORM-2對肥胖狀態(tài)下FFA引起的巨噬細(xì)胞炎癥有抑制作用。

在小鼠RAW264.7模型中，CO可以顯著抑制由脂多糖(LPS)刺激的促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(CM-CSF)產(chǎn)生；促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10產(chǎn)生，其機(jī)制可能是通過p38MAPK通路調(diào)節(jié)[6]。CO可通過阻止I-κΒα的磷酸化和降解抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB活性；CO還可抑制LPS誘導(dǎo)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的活性，抑制TLR的膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而抑制配體誘導(dǎo)的活性氧的產(chǎn)生[7]。以上結(jié)果提示，CO對LPS引起的炎癥有抑制作用。另外，Dancer等[8]觀察到抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)可以減輕肺纖維化程度，而CORM-2可以通過調(diào)節(jié)NF-κB途徑調(diào)節(jié)MMP-2的釋放。朱楠等[9]研究發(fā)現(xiàn)CORM可顯著抑制腎臟固有樹突狀細(xì)胞表達(dá)TLR4，也可抑制LPS刺激和缺血損傷時炎癥因子的表達(dá)，但對于TLR4缺陷小鼠這一抑制作用消失，提示CORM對內(nèi)源性配體介導(dǎo)的固有樹突狀細(xì)胞活化過程的抑制作用由TLR4信號通路介導(dǎo)。最新的研究發(fā)現(xiàn)CORM具有抑制血小板聚集[10],抑制內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)[11]等作用。Tejero等[12]研究證實(shí)，動物接受低劑量(1/20的致死量)的CO可極大提高動物對高氧性損害的耐受性，HO-1/CO系統(tǒng)還可通過下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞源性促炎遞質(zhì)包括細(xì)胞間黏附因子、血管細(xì)胞黏附因子、E-選擇素等來抑制白細(xì)胞的黏附、聚集，拮抗炎癥的發(fā)生及發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)用FFA干預(yù)巨噬細(xì)胞，模擬人體肥胖狀態(tài)下的炎癥狀態(tài)，用CORM-2干預(yù)后，炎性蛋白p-NF-κB的表達(dá)明顯降低，TNF-α及IL-6水平下降，驗(yàn)證了FFA可以引起巨噬細(xì)胞炎癥，同時發(fā)現(xiàn)CORM-2對肥胖狀態(tài)下的炎癥有抑制作用，可能是通過抑制炎癥信號通路NF-κB起作用，為CO改善肥胖狀態(tài)下炎癥引起的胰島素抵抗和CO治療糖尿病、代謝綜合征提供了理論依據(jù)。

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