二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化青霉產(chǎn)α-葡萄糖苷酶培養(yǎng)基

陳桂光，符佳精，谷嶺麗，梁鈺婷，梁智群*

（廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530000）

α-葡萄糖苷酶（alpha-glucosidase，EC.3.2.l.20）系統(tǒng)命名為α-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，又名α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，相對分子質(zhì)量一般在40000u～145000u[1]，其可以從低聚糖類底物的非還原末端切開α-1，4糖苷鍵，釋放出葡萄糖或?qū)⒂坞x出的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到另一糖類底物形成α-1，6糖苷鍵，從而得到非發(fā)酵性的低聚異麥芽糖或糖酯、糖肽等[2-5]。

二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計[6-9]是旋轉(zhuǎn)設(shè)計的一種，其不僅基本保留了回歸正交設(shè)計的優(yōu)點，還能根據(jù)測值，直接尋求最優(yōu)區(qū)域[10]，精確對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)確有效的分析，從而得到最優(yōu)工藝參數(shù)的一種試驗設(shè)計方法化。這種實驗設(shè)計方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于微生物培養(yǎng)基的優(yōu)化[11-12]。

α-葡萄糖苷酶作為工業(yè)化生產(chǎn)低聚糖異麥芽（IMO）[13-15]最關(guān)鍵的酶而備受國內(nèi)外食品界的重視。研究開發(fā)α-葡萄糖苷酶，提高低聚異麥芽糖產(chǎn)量，具有很廣泛的應(yīng)用價值。本研究以青霉作為發(fā)酵產(chǎn)酶菌種，采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計對產(chǎn)α-葡萄糖苷酶培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，提高α-葡萄糖苷酶活力，為低聚異麥芽糖的擴(kuò)大發(fā)酵及工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青霉菌（Penicilliumsp.Mc221）：由廣西大學(xué)食品發(fā)酵所保存。

J2-21高速冷凍離心機(jī)；島津高效液相色譜儀。

1.2 培養(yǎng)基

斜面保存培養(yǎng)基：PDA，自然pH值。

起始發(fā)酵培養(yǎng)基：10%麥芽糖、0.4%酵母膏、1%蛋白胨、0.05%MgSO4·7H2O、0.05%KH2PO4、自然pH值。

土豆汁：稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水煮沸30min用4層紗布過濾，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至1000mL。

麩皮汁：稱取100g麩皮，加水煮沸40min用4層紗布過濾，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至1000mL。

以上培養(yǎng)基滅菌條件均為：121℃、20min。

1.3 主要試劑

麥芽糖、異麥芽糖、潘糖等標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma 公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 酶活定義及測定方法

1.4.1 α-葡萄糖苷酶活力單位定義[16]

在40℃、pH5.0的條件下，每小時催化麥芽糖生成1μmol潘糖的酶量定義為1個酶活力單位（U/mL）。

1.4.2 酶活測定方法

離心收集1mL發(fā)酵液中的菌體，用無菌水漂洗3次后加入1mL 18 %（w/v）的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液中（含0.2mol/L PBS，0.1%TtritonX-100，pH5.0），40℃反應(yīng)2h；沸水中10min滅酶活后流水冷卻至室溫；12000r/min，離心10min后用0.45μm濾膜過濾得到樣品溶液。空白：離心收集菌體后，沸水中10min滅酶活后流水冷卻至室溫，再加入麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液液中，其他操作與樣品相同。用HPLCasil參照GB/T 20881-2007國家標(biāo)準(zhǔn)檢測潘糖的生成量。

1.5 產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化

1.5.1 單因素試驗

以酶活力作為評價指標(biāo)，對產(chǎn)酶影響較大的麥芽糖（1%～15%，w/v）、麩皮汁/土豆汁比（1/4～2/1，v/v）、蛋白胨（0.5%～3%，w/v）進(jìn)行單因素優(yōu)化，其實驗結(jié)果見圖1～圖3。

由圖1可知，在麥芽糖濃度為1%～10%時有利于產(chǎn)酶，麥芽糖濃度為5%時酶活力最大4.12U/mL。

由圖2可知，菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的活力隨麩皮汁與土豆汁比值的增大先大后減小，麩皮汁與土豆汁比值在1/2～2/1之間時有利于產(chǎn)酶，當(dāng)麩皮汁與土豆汁比值1/1時酶活力最大。

由圖3可知，隨蛋白濃度的逐漸增加，酶活力先增加后減小，蛋白胨濃度為0.5%～2%之間時有利于產(chǎn)酶，蛋白胨濃度為1%時有最大酶活力3.9U/mL。

圖1 麥芽糖濃度對產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of maltose on enzyme production

圖2 麩皮汁與土豆汁比值對產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of bran juice/potato juice on enzyme production

圖3 蛋白胨對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of peptone on enzyme production

1.5.2 二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗

根據(jù)單因素試驗選擇的3個對產(chǎn)酶的主要影響因子麥芽糖、麩皮汁/土豆汁、蛋白胨，采用3因素二次正交旋轉(zhuǎn)組合的試驗設(shè)計方法，首先，選擇3因素的上下限值（Z1j，Z2j），根據(jù)公式：Z0j=（Z1j+Z2j）/2，△j=（Z2j-Z0j）/γ計算出零水平Z0j和變化間隔△j，編制因素水平編碼表，見表1。根據(jù)軟件中的3因素二次正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計試驗方案進(jìn)行試驗。以α-葡萄糖苷酶活力作為響應(yīng)值，并記錄試驗數(shù)據(jù)。麥芽糖、蛋白胨、麩皮汁/土豆汁與酶活力分別用X1、X2、X3、Y表示。

1.6 數(shù)據(jù)分析處理

采用DPS軟件和Excel對數(shù)據(jù)分析處理及圖形的制作，求得響應(yīng)值最大時各培養(yǎng)基的最優(yōu)配比。

表1 實驗因素水平Table 1 Factors and levels of the experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶培養(yǎng)基數(shù)學(xué)模型的建立與檢驗

3因素二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗結(jié)果見表2。利用DPS軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對試驗結(jié)果（表2）進(jìn)行分析（表3），得到麥芽糖（X1）、蛋白胨（X2）、麩皮汁/土豆汁（X3）與酶活力（Y）的數(shù)學(xué)模型回歸方程為：

在顯著水平為0.1的條件下，通過方差分析得出F失擬=0.74787＜F0.01（5.8）=6.63，表明未知因素對試驗結(jié)果影響很小，可以忽略，F(xiàn)回歸=217.36494＞F0.01（9.13）=4.19，達(dá)到極顯著水平，說明模型成立。預(yù)測值和實際值吻合較好，此模型進(jìn)行預(yù)報具有較高的可行性。

表2 3 因素二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計實驗方案及結(jié)果Table 2 Design and result of quadratic orthogonal rotation

表3 實驗結(jié)果方差分析表Table 3 Results and variance analysis

對回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗，在α=0.1顯著水平剔除不顯著項，得到優(yōu)化后的方程為：

α-葡萄糖苷酶活力與麥芽糖、麩皮汁/土豆汁、蛋白胨的相關(guān)系數(shù)（R2）=回歸平方和/總平方和=99.34%，表明該數(shù)學(xué)模型的3個因素對α-葡萄糖苷酶活力的影響占99.34%，其他因素的影響和誤差占0.66%。

2.2 產(chǎn)酶培養(yǎng)基數(shù)學(xué)模型解析

2.2.1 單因子效應(yīng)分析

由于設(shè)計中各因素處理進(jìn)行正交編碼，回歸模型中的統(tǒng)計值已相對獨立，反映各因素與試驗結(jié)果的時候，只需要把其他2個因素固定在零水平上就可得到各因子與效價值的關(guān)系，得到的偏回歸方程為：

由以上3個方程得到單因子效應(yīng)分析見圖4。

圖4 單因子效應(yīng)Fig.4 Effect of single factor on enzyme activity

從圖4可知，各因子相對重要性在不同的水平條件下表現(xiàn)是不同的。不同因子在不同的水平上能獲得最高酶活力。在3個因素中麥芽糖含量的變化對酶活力影響較大，其他2個因素對酶活力的影響相對比較穩(wěn)定。麥芽糖，麩皮汁/土豆汁，蛋白胨均成開口向下的拋物線，表明3因素均存在一個合理的范圍，即對產(chǎn)酶的影響均是先上升后下降。

2.2.2 主效應(yīng)分析

直接辨別法：根據(jù)偏回歸系數(shù)b的絕對值可直接辨別各因子對產(chǎn)量的影響程度，由偏回歸方程（3）、（4）、（5）可知：|b1|＞|b3|＞|b2|，即各因子對酶活力的影響程度大小依次為：麥芽糖，麩皮汁/土豆汁，蛋白胨。

2.2.3 兩因子互作效應(yīng)分析

根據(jù)表3二次多項模型極其各項的方差分析表可以看出，交互項X1X2、X1X3的p值均小于顯著水平0.1，因此X1X2、X1X3交互作用顯著，即麥芽糖與蛋白胨、麥芽糖與麩皮汁/土豆汁互作效應(yīng)對產(chǎn)酶有明顯影響。而X2X3的P值大于顯著水平0.1，互作效應(yīng)不明顯。

對這兩項對交互作用進(jìn)行分析。把另外一個因素固定在零水平，得到交互作用方程：

由以上兩個交互作用方程得到圖5～圖6。

5條曲線均成開口向下的拋物線，均有最大值，酶活力隨交互作用變化先曾大后減小。由圖2、圖3可知，當(dāng)?shù)鞍纂吮戎狄欢〞r，隨著麥芽糖的增加酶活力先增大后減小，這可能是因為麥芽糖作為底物隨著麥芽糖濃度的增加對酶產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致酶活力下降，當(dāng)麥芽糖一定時，酶活力隨蛋白胨的增加先增大后減小；當(dāng)麩皮汁/土豆汁一定時，隨著麥芽糖的增加酶活力先增大后減小，這可能是因為麥芽糖作為底物濃度增高對酶產(chǎn)生抑制作用；當(dāng)麥芽糖一定時酶活力隨麩皮汁/土豆汁比值的增加先增大后減小。

圖6 X1(麥芽糖) 與X3(麥芽汁/土豆汁) 互作效應(yīng)對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of interaction between X1(Maltose) and X3(Potato juice/Wort juice) on enzyme activity

2.3 產(chǎn)酶培養(yǎng)基模型的優(yōu)化及驗證

通過DPS軟件對試驗結(jié)果分析可知，酶活力大于3.69U/mL方案有24個（對于數(shù)學(xué)模型的分析見表6），通過軟件尋優(yōu)，在酶活力大于3.69U/mL的24個方案中，得到當(dāng)響應(yīng)值Y值（酶活力）為最大時，3個因素的水平取在代碼值為（0、0、1），即當(dāng)麥芽糖5.5%、蛋白胨1.25%、土豆汁/麥芽汁3/2。此時的酶活力達(dá)到最大Ymax為4.2U/mL。表4中的最佳方案就是產(chǎn)酶培養(yǎng)基的最優(yōu)的優(yōu)化區(qū)域范圍。

表4 酶活力大于3.69(u/ml)方案Xi 的頻率分布表Table 4 Probability distribution of Xi in enzyme activity greater than 3.69(u/ml)

以優(yōu)化得到的產(chǎn)酶培養(yǎng)基配比進(jìn)行3 次重復(fù)發(fā)酵驗證試驗，分別測得酶活力Y值為4.19U/mL、4.24U/mL和4.26U/mL，平均值為4.23U/mL，試驗值與模型的理論值相差0.03U/mL，與預(yù)測值4.2U/mL基本符合。

3 結(jié)論

（1）本研究采用3因素二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗法，建立了麥芽糖、麩皮汁/土豆汁、蛋白胨3個因素的回歸模型：

（2）分析了3因素和因素之間作效應(yīng)對產(chǎn)酶的影響，比較了3因素對產(chǎn)酶的影響大小為：麥芽糖＞麩皮汁/土豆汁＞蛋白胨。

（3）通過DPS軟件分析并通過產(chǎn)酶試驗驗證得到青霉產(chǎn)α-葡萄糖苷酶培養(yǎng)基的最佳組合為麥芽糖5.5%、蛋白胨1.25%、土豆汁/麥芽汁3/2。此時酶活力達(dá)到4.23U/mL，比優(yōu)化前酶活力2.49U/mL提高41.1%。

（4）本研究也證明了二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)試驗法能夠快速、準(zhǔn)確地對青霉產(chǎn)α-葡萄糖苷酶培養(yǎng)基中主要影響因子進(jìn)行優(yōu)化與評價，并能得到各因素最佳組合。

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