納豆激酶液體發酵條件優化的研究

王艷艷，鄧啟華

（北京燕京啤酒股份有限公司技術中心，北京 101300）

納豆激酶（Nattokinase）是1987年由日本學者從納豆中提取的一種絲氨酸蛋白酶，該酶不僅具有明顯的溶栓能力，還可以激活體內的纖溶酶原，從而增加內源性纖溶酶的量與作用[1-3]。目前臨床上使用的治療心腦血管栓塞的藥品如尿激酶（urokinase，UK），鏈激酶（streptokinase，SK），組織型纖溶酶原激活物（tissue-type plasminogenactivator，tpA）等均在不同程度上存在一定的缺陷（毒性較強，副作用較大；體內半衰期短，難以發揮藥效；來源緊缺，價格昂貴），而納豆激酶有望彌補這些缺陷，成為新一代的溶栓藥物[4-8]。納豆激酶是納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilisNatto）的代謝產物，納豆激酶的生產普遍采用固體發酵大豆制備納豆，然后從納豆中分離純化的方法得到，而在固體發酵過程中染菌，散熱問題一直未能得到很好的解決[9-10]。相對而言，納豆激酶液體發酵生產工藝簡單，成本低廉，因此進行納豆激酶液體發酵工藝的研究是非常有必要的，而對納豆激酶液體發酵條件進行全面優化是這一研究工作的關鍵所在。

本實驗對納豆激酶的液體發酵條件進行了系統研究，通過正交試驗確定最佳發酵培養基，并運用響應面分析法對發酵條件進行了優化，利用Box-Benhnken的中心組合試驗設計，對試驗數據進行響應面分析[11-12]，并對擬合數學模型進行了較為詳細的描述，最終對納豆激酶液體發酵工藝進行了優化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

納豆芽孢桿菌來自于燕京中發生物技術有限公司。

1.1.2 試劑

蚓激酶：中國藥品生物制品檢定所；凝血酶、纖維蛋白原：中國食品藥品檢定研究院；瓊脂糖、葡萄糖、木糖、玉米淀粉、大豆蛋白胨、動物蛋白胨、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2及MgSO4·7H2O等均為國產試劑。

1.1.3 培養基

斜面培養基：平板計數培養基。

種子培養基：營養肉湯培養基。

基礎培養基：葡萄糖2%，大豆蛋白胨4%，KH2PO40.1%，K2HPO40.1%，CaCl20.02%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 7.0～7.2。

培養條件：從斜面上挑取一環菌苔接入種子培養基中，37℃、150r/min振蕩培養至對數期，隨后將種子液按一定比例接種于裝有100mL培養基的500mL錐形瓶中，培養48h結束后離心取上清液測定酶活。

1.2 儀器與設備

ZHWY-111C型恒溫培養振蕩器：上海智誠分析儀器制造有限公司；5804R型離心機：德國Eppendorf公司；LDZH-150KBS立式壓力滅菌器：上海申安醫療器械廠；SPECORD205型紫外可見分光光度計：德國Anylytikjena公司；8417型pH計：意大利Hanna公司；BX-240H電子天平：日本島津公司；LRH-250生化培養箱：日本SANYO公司。

1.3 方法

1.3.1 繪制納豆芽孢桿菌的生長曲線

將培養好的種子液接入基礎培養基中，37℃、150r/min振蕩培養，每隔2h取樣，以未接種的培養基為空白，測波長600nm處的吸光度值（OD600nm），繪制納豆芽孢桿菌的生長曲線，根據納豆芽孢桿菌的對數生長期確定最適種齡。

1.3.2 發酵培養基配方的優化

發酵培養基的碳氮源及碳氮比優化：通過單因素試驗對基礎培養基的碳、氮源及碳氮比進行了初步研究，確定出產酶量比較高的3種碳源、氮源及碳氮比。在此基礎上采用L9（34）正交試驗法對碳源、氮源及碳氮比3個影響因素進一步研究，最終確定出發酵培養基的最佳碳氮源配方。

發酵培養基的無機鹽濃度優化：采用L9（34）正交試驗對基礎培養基的無機鹽（MgSO4，CaCl2及K2HPO4/KH2PO4）的濃度進行優化，確定出發酵培養基的最佳無機鹽組成。

1.3.3 響應面分析法確定最佳液體發酵條件

以優化后的發酵培養基培養納豆芽孢桿菌，通過單因素試驗對發酵的條件（接種量，裝液量，發酵溫度，初始pH值）進行初步分析，隨后依據Box-Benhnken試驗設計對發酵條件進行3因素3水平的響應面分析試驗，包括12個析因試驗和3個中心試驗。利用統計軟件Minitab15[13-14]對試驗數據進行分析，確定出最佳發酵條件。

1.3.4 納豆激酶活力測定

納豆激酶的酶活采用瓊脂糖纖維蛋白平板法[15]進行測定，以蚓激酶作酶活的標準曲線。

1.3.5 酶活定義酶活定義為：在37℃，pH 7.8的條件下，1min內溶解1μmol纖維蛋白所需的酶量為1U。

2 結果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌的生長曲線

從發酵開始連續測定OD值大約30h，最終得到的納豆芽孢桿菌的生長曲線見圖1。

由圖1可知，納豆芽孢桿菌在0～6h時為停滯期，6h后開始進入對數期，大約至24h時對數期結束。由于納豆芽孢桿菌在對數生長期時菌體生命力極為旺盛，此時將種子液進行轉接既可以避免生長緩慢、發酵周期過長，又不會導致菌體過早自溶，因此可以確定納豆芽孢桿菌在種子液中培養18h～20h后接入發酵培養基中最為適宜，選取18h～20h作為納豆芽孢桿菌的種齡。

圖1 納豆芽孢桿菌的生長曲線Fig.1 The growth curve ofBacillus subtilis Natto

2.2 發酵培養基的確定

2.2.1 發酵培養基的最佳碳氮源及碳氮比確定

通過前期的單因素試驗確定出相對產酶量比較高的碳源為玉米淀粉、葡萄糖、木糖；比較適宜的氮源為大豆蛋白胨、動物蛋白胨及大豆粉；碳氮比確定為4%/2%、4%/4%、2%/4%。采用正交試驗對發酵培養基的碳源、氮源及碳氮比進行了優化。正交試驗因素水平見表1，試驗結果見表2。

表1 發酵培養基碳氮源配方正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test for the optimization of carbon and nitrogen formula in the medium

表2 發酵培養基碳氮源配方正交試驗結果Table 2 Results of the orthogonal test for the optimization of carbon and nitrogen formula in the medium

由表2可知，3個因素對產酶影響的順序為A＞B＞C。由k值得到的最佳配比為玉米淀粉2%，動物蛋白胨4%；從表2結果來看，酶活最高的配比為玉米淀粉4%，動物蛋白胨4%。

對這2種碳氮源配比進行發酵驗證試驗，試驗結果見表3。

表3 發酵培養基碳氮比配方正交試驗驗證試驗Table 3 Verification test of the orthogonal test for the optimization of carbon and nitrogen formula in the medium

由表3可知，通過驗證試驗確定最佳碳氮源配比為玉米淀粉2%，動物蛋白胨4%。

2.2.2 發酵培養基的無機鹽濃度確定

微生物在生長繁殖和生產過程中，需要某些無機鹽和礦物質元素作為其生理活性物質的組成或生理活性作用的調節物。這些物質一般在低濃度時對微生物生長和產物合成有促進作用，在高濃度時常表現出明顯的抑制作用。因此選擇合適的無機離子濃度是非常重要的。在眾多無機離子中，鉀、鈣、鎂等陽離子是許多酶的激活劑，影響蛋白質的合成。通過正交試驗研究了MgSO4·7H2O，CaCl2及K2HPO4/KH2PO4對產酶的影響，因素水平見表4，試驗結果見表5。

表4 發酵培養基無機鹽濃度正交試驗因素水平Table 4 Factors and levels of the orthogonal test for the optimization of medium inorganic concentration

表5 發酵培養基無機鹽濃度正交試驗結果Table 5 Results of the orthogonal test for the optimization of medium inorganic concentration

由表5可知，CaCl2對產酶有明顯的促進作用。通過k值得到無機鹽的最佳濃度為MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl20.01%，K2HPO4/KH2PO40.1%/0.1%。由正交試驗直觀分析結果可知，產酶最高的無機鹽濃度為MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl20.01%，K2HPO4/KH2PO40.3%/0.1%。對所得結論進行驗證試驗，試驗結果見表6。

表6 發酵培養基無機鹽濃度的驗證試驗Table 6 Verification test of the medium inorganic salt concentration

由表6的酶活結果來看，最佳的無機鹽濃度為MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl20.01%，K2HPO4/KH2PO40.3%/0.1%。

通過正交試驗確定了納豆激酶液體發酵的最佳培養基為玉米淀粉2%，動物蛋白胨4%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl20.01%，K2HPO4/KH2PO4為0.3%/0.1%。

2.3 響應面分析法確定最佳液體發酵條件

以優化后的培養基液體發酵納豆芽孢桿菌，通過單因素試驗考察了接種量、裝液量、發酵溫度、初始pH值對產酶的影響。由單因素試驗結果可知，最佳裝液量為50mL/500mL錐形瓶。接種量、發酵溫度、初始pH值對產酶影響顯著。

根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，并結合單因素試驗結果，進行3因素3水平的響應面分析試驗。因素水平見表7。

表7 響應面試驗因素與水平Table 7 Factors and levels of the response surface test

以接種量（A）、發酵溫度（B）、初始pH值（C）為自變量，以培養48h后測得納豆激酶酶活為響應值（Y），進行響應面分析，試驗方案及結果見表8。

利用Minitab15對試驗數據進行二次多項回歸擬合，建立二次響應面回歸模型，優化各因素水平。具體的分析結果見表9、表10。

由表9可知，B的線性項，A、B、C的平方項對納豆激酶酶活具有顯著作用。另外，B與C的交互作用也是比較顯著的。該模型的決定系數R2=0.912，說明回歸方程的擬合程度較好。根據表9得到納豆激酶酶活（Y）對接種量、發酵溫度、初始pH值的二次回歸方程式：

表8 響應面分析方案及試驗結果Table 8 Scheme and results of the response surface test

表9 納豆激酶酶活的估計回歸系數Table 9 Estimated regression coefficient of Natto kinase activity

表10 納豆激酶酶活的估計回歸系數表的方差分析Table 10 Variance analysis of estimated regression coefficient of Nattokinase activity

由表10可知，該模型的p值為0.003，小于0.01，說明該模型的回歸顯著。失擬的p值為0.072，大于0.05，這說明該模型的失擬不顯著。

利用Minitab15所生成的響應曲面分析圖見圖2～圖4。

圖2 納豆激酶酶活與發酵溫度，接種量的曲面圖及等值線圖Fig.2 Response surface and contour plot of natto kinase activity,fermentation temperature,and inoculation size

圖3 納豆激酶酶活與初始pH值，接種量的曲面圖及等值線圖Fig.3 Response surface and contour plot of natto kinase activity,initial pH and inoculation size

圖2～圖4表明，當某一因素達到最佳水平時，其他2個獨立因素之間的相互作用。從3個響應面曲面圖看出，發酵溫度對納豆激酶酶活的影響比較顯著。由相應的等高線圖可知，發酵溫度與接種量、初始pH值與接種量的等高線圖接近圓形，交互作用不顯著，而發酵溫度與初始pH值的等高線圖呈橢圓形，交互作用顯著。

圖4 納豆激酶酶活與初始pH值，發酵溫度的曲面圖及等值線圖Fig.4 Response surface and contour plot of natto kinase activity,initial pH and fermentation temperature

由Minitab15對回歸方程進行分析得到優化后的條件：接種量3.14%，發酵溫度36.05℃，初始pH值為6.83。為方便操作，優化后的條件改為接種量3.1%，發酵溫度36℃，初始pH值為6.8。納豆激酶酶活的最大估計值為32.22kU/mL。在所得的優化條件下進行3次驗證試驗，所得的納豆激酶酶活分別為31.32kU/mL、33.25kU/mL、33.61kU/mL，平均值為32.73kU/mL，實驗值與理論預測值非常接近，這說明該模型可以較好地預測實際發酵情況，并證明了利用響應面優化納豆激酶液體發酵條件的可行性。

3 結論

本實驗利用正交試驗法和響應面分析法對納豆激酶液體發酵條件進行了系統研究。通過監測納豆芽孢桿菌的生長曲線確定出18h～20h為最適種齡。利用正交試驗對培養基組成進行了優化，確定出發酵的最佳培養基為玉米淀粉2%，動物蛋白胨4%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl20.01%，K2HPO4/KH2PO40.3%/0.1%。隨后由響應面分析法對納豆激酶液體發酵條件進行了優化，根據Box-Benhnken試驗設計建立了發酵條件的二次多項數學模型，并利用Minitab15軟件對模型進行了顯著性檢驗，得到了優化后的發酵條件：初始pH值為6.8，裝液量50mL/500mL錐形瓶，接種量3.1%，發酵溫度36℃。經過優化，發酵48h后的納豆激酶酶活從12.47kU/mL提高為32.73kU/mL。

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