膝骨關節炎滑膜不同部位基質金屬蛋白酶3的表達及臨床意義

李守龍 艾依熱提·買買提 潘海濤 曾 崢

(1.首都醫科大學附屬北京天壇醫院骨科，北京 100050;2.新疆油田公司明園職工醫院外科，烏魯木齊 830000)

膝骨關節炎(osteoarthritis of knee，KOA)炎性反應滑膜、滑膜內血管組織及浸潤的炎性反應細胞可分泌炎性介質及軟骨溶解酶至關節滑液中，通過關節滑液破壞軟骨細胞外基質［1］。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)與其抑制劑即金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitors of matrix metalloprotein-ase，TIMPs)的平衡是維系關節軟骨細胞外基質穩定的關鍵因素。基質金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)是導致軟骨破壞的關鍵酶，當MMP-3的活性增高，并超過了TIMPs的增高程度時，MMPs/TIMPs失平衡，促使關節軟骨基質的降解，導致KOA的發生。臨床工作中發現KOA患者膝內側疼痛癥狀出現早，關節間隙狹窄明顯。本實驗通過研究KOA滑膜不同部位MMP-3的表達強度及其臨床意義，討論MMP-3在KOA發病中的作用，為KOA臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料和標本來源

選取首都醫科大學附屬北京天壇醫院2010年7月至2012年3月收治的48例KOA患者為研究對象，其中男性16例，女性32例，年齡48～63歲，平均年齡53.4歲，病史最短1.5年，最長12年，平均4.5年。納入標準:①符合骨關節炎的診斷依據［2］，并經膝關節鏡檢查術證實;②雙膝均患KOA者，以癥狀嚴重側入選;③無心血管、肝、腎等重要臟器病變;④排除活動性消化性潰瘍及其病史;⑤排除類風濕、感染性關節炎等其他關節疾患;⑥入選病例術前4周未使用非甾體類消炎藥(non-steroid anti-inflammatory drugs，NSAIDs)、皮質醇或具有消炎鎮痛作用的中藥制劑。⑦術前均有膝關節疼痛。術前拍攝站立位患膝正側位X線片進行Kellgren-Lawrence分級。所有患者均行膝關節鏡檢及關節滑膜清理術，術中分別取內側間室、髕上囊及外側間室滑膜。

1.2 主要試劑及耗材

兔抗人MMP-3多克隆抗體及一抗稀釋液由北京嘉美諾斯生物科技有限公司提供，二抗EDTA 9.0及PV-6000即用型二步法檢測試劑盒由北京中杉金橋生物技術有限公司提供，CR機(Siemens公司，德國)由首都醫科大學附屬北京天壇醫院放射科提供。萊卡自動脫水機、DAB顯色劑、PBS緩沖液、蒸餾水由北京天壇醫院病理科提供。

1.3 實驗方法

術中所取滑膜標本用體積分數為10%的中性甲醛固定，萊卡自動脫水機脫水(全程14 h)，58℃～60℃石蠟包埋，切取4 μm厚切片，行針對MMP-3的HE染色及免疫組化染色。切片常規脫蠟至水。0.3%H2O2中室溫孵育10 min。微波抗原修復，92℃～98℃，5 min。正常山羊血清封閉液室溫孵育20 min，滴加一抗，置于37℃溫箱中60 min。滴加生物素化的羊抗兔Ⅱ抗，置于37℃的溫箱中60 min，DAB顯色。陰性對照標本用PBS代替一抗。蘇木素復染、脫水、透明、封片、鏡下觀察。

1.4 結果判定

1)免疫組化染色結果判定:采用半定量積分法［3］，分別對每張切片的陽性細胞染色強度及陽性細胞率進行分級記分:①0、1、2、3分依次表示陽性細胞染色強度為陰性、弱陽性、陽性及強陽性;②陽性細胞率:每張切片計數5個40×10倍視野細胞，根據陽性細胞所占比例分級:無著色細胞或僅有﹤10%觀察細胞著色，0分;陽性細胞數10%～25%，1分;陽性細胞數25%～50%，2分;陽性細胞數50%～70%，3分;陽性細胞數70%～100%，4分。根據2項之和確定滑膜MMP-3表達強度。

2)臨床評分方法:應用綜合評分方法［4］，根據患者病史及臨床查體、X線所見，匯總臨床癥狀(疼痛、行走困難)、體征(關節腫脹、關節活動受限程度)及X線K-L分級5項指標，各項指標按無、輕、中、重分別計為0、1、2、3分，最高分為15分，對KOA患者作出臨床評分。

1.5 統計學方法

使用統計學軟件SPSS 17.0進行數據處理，計量數據以均數±標準差()表示。不同部位滑膜MMP-3表達強度比較采用單因素重復測量數據方差分析和兩兩比較檢驗。滑膜MMP-3表達強度與臨床評分的關系采用相關系數r表示。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KOA滑膜不同部位MMP-3表達強度比較

MMP-3在KOA滑膜標本中的滑膜襯里細胞層、滑膜襯里下層均見陽性表達，其中主要是滑膜細胞、血管內皮細胞和浸潤的淋巴細胞、單核細胞著色明顯，表現為胞核深染，胞質中可見棕黃色或棕褐色顆粒分布(圖1)。細胞外基質中也可見少量棕黃色顆粒均勻分布。MMP-3表達強度:內側間室滑膜＞髕上囊滑膜＞外側間室滑膜，兩兩間差異有統計學意義，詳見表1。

圖1 KOA滑膜MMP-3免疫組化染色Fig.1 Immunohistochemical staining for MMP－3 in synovial membrane of KOA(400×)

圖2 KOA滑膜不同部位MMP-3表達強度與臨床評分的相關關系Fig.2 Correlation of MMP－3 expression intensity in different sites of KOA synovial membrane with clinical scores KOA:osteoarthritis of knee;MMP-3:matrix metalloproteinase-3.

表1 KOA滑膜不同部位MMP-3的表達強度及臨床評分Tab.1 Expression of MMP－3 in different sites of KOA synovial membrane and clinical scores()

表1 KOA滑膜不同部位MMP-3的表達強度及臨床評分Tab.1 Expression of MMP－3 in different sites of KOA synovial membrane and clinical scores()

*P＜0.001 comparisons of every two sites in expression intensity of MMP-3 apso showed significant difference;KOA:osteoarthritis of knee;MMP-3:matrix metalloproteinase.

Sites Expression intensity Medial compartment 3.45±0.22*Suprapatellar bursa 2.69±0.21*Lateral compartment 1.99±0.16*Clinical scores 8.75±2.18 F 0.000 70.706 P

2.2 KOA滑膜不同部位MMP-3表達強度與臨床評分相關性

經多元線性回歸分析，臨床評分與內側間室滑膜、髕上囊滑膜、外側間室滑膜MMP-3表達強度間無多元線性關系(P=0.572)。內側間室及髕上囊滑膜MMP-3表達強度與臨床評分分別呈正相關關系(圖2)，相關系數分別為 r1=0.894(P=0.000)，r2=0.803(P=0.000)。外側間室滑膜MMP-3表達強度與臨床評分無相關性r3=0.485(P=0.057)。

3 討論

KOA滑膜炎導致的關節疼痛是KOA患者疼痛的重要原因，疼痛多是KOA患者的最初表現且先于X線或MRI的影像學表現而出現，滑膜炎性反應參與了KOA 的整個病理過程［5-6］。有研究［7］發現，KOA 滑膜中浸潤的炎性細胞包括T輔助淋巴細胞、抑制性T淋巴細胞、B淋巴細胞及單核巨噬細胞，主要存在于滑膜襯里細胞層、滑膜襯里細胞下層以及小血管周圍。Hollander等［8］發現在離體條件下，由滑膜所分泌的關節滑液破壞關節軟骨的作用強于血清中細胞因子，差異有統計學意義。滑膜釋放的炎性介質IL-1β等可通過旁分泌或自分泌作用，使MMPs活性及含量增加，從而導致軟骨基質分解，加劇KOA的進程;IL-1β以及TNF-α又可通過激活細胞間因子NF-κB，后者可抑制軟骨再生所必需的轉錄因子SOX9的表達，從而抑制軟骨合成、修復，進一步加重關節軟骨破壞［9］，呈現出一種惡性循環。

KOA滑膜炎性反應是關節軟骨或軟骨下骨破壞崩解后形成的二氫焦磷酸鈣結晶、軟骨碎屑導致的繼發反應［7］，KOA滑膜為了溶解吸收關節腔內磨損脫落的關節軟骨碎屑，代償性增生、肥厚并分泌軟骨溶解酶(包括MMP-3)，軟骨碎屑溶解的同時，正常的關節軟骨也同樣被溶解。Ishimaru等［10］證實患膝疼痛的KOA患者關節液及血清中MMP-3濃度明顯高于無痛患者，且MMP-3濃度與疼痛程度強烈相關，但與X線分級無相關性，由此可推測疼痛與KOA導致的滑膜炎性反應有關，進而與滑膜中MMP-3表達強度呈正相關。目前測定滑膜中MMP-3表達強度的研究報道少見，本實驗應用免疫組織化學方法研究KOA滑膜不同部位MMP-3的表達強度，結果發現內側間室滑膜中MMP-3的表達，內側間室＞髕上囊＞外側間室。臨床工作中發現，患膝內側及髕上囊疼痛、壓痛癥狀往往較外側重，其中以膝內側癥狀為最重，且關節間隙明顯狹窄。結合實驗結果，可以推測KOA膝內側間室滑膜MMP-3表達強度較其他部位滑膜升高可能為患膝內側臨床癥狀顯著的原因之一。

MMP-3的表達增高導致的KOA關節軟骨破壞以及滑膜炎性反應可以刺激體內傷害性感受系統，除產生主觀痛覺外，釋放到關節腔內的炎性反應介質如P物質(P substance，SP)、降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)、緩激肽等能夠降低外周傷害性感受器的沖動產生閾值，使其對痛性刺激更易感［11-13］。陳百成等［14］發現神經生長因子 (nerve growth factor，NGF)和SP在KOA內下方滑膜中表達增多，感覺神經纖維在內下方滑膜處增多，內下方滑膜對傷害性刺激更敏感。另有研究［15］表明NGF在KOA患者滑膜組織的表達與KOA患者疼痛以及關節功能障礙呈正相關，內側間室滑膜CGRP表達較外側間室及髕上囊增多［16］，內側間室SP染色陽性神經纖維分布較正常密集，分布密度與疼痛VAS評分正相關［17］，這些與本實驗得出的MMP-3在內側間室滑膜表達較強的結果的意義相同，都可能是膝內側疼痛和壓痛癥狀顯著的原因。滑膜內陽性神經纖維存在于滑膜襯里細胞層，并有神經纖維分支走向關節腔方向，而在襯里細胞下層，SP陽性細胞主要存在于滑膜血管周圍，相當數量的SP陽性纖維存在于半月板與滑膜連接處［18］，結合上述研究發現，這支持臨床上行膝關節鏡下滑膜清理術后患膝疼痛減輕的現象，切除增生、肥厚滑膜可使滑膜中發放痛覺沖動的傷害性感受器減少，同時阻斷了痛覺沖動的向上傳導，臨床上表現為患膝疼痛減輕。

國內外關于髕上囊滑膜與外側滑膜中MMP-3表達強度或SP陽性神經纖維分布密度以及NGF表達強度比較的研究較少，本研究除發現內側間室滑膜MMP-3表達強度高于髕上囊及外側間室滑膜外，還得出髕上囊滑膜MMP-3表達強度高于外側間室滑膜，雖然實驗結果受滑膜標本甲醛中貯存時間以及抗體純度、免疫組化染色過程中操作技術水平、鏡下觀片判斷等因素的影響，但入選患者亦存在不同程度的髕上囊部位壓痛，故髕上囊滑膜MMP-3表達強度高于外側間室滑膜的結論仍具有一定參考意義，它為臨床上決定滑膜切除范圍提供了依據，即關節鏡滑膜清理術中主要切除內側間室、髕上囊滑膜可以緩解疼痛癥狀。

KOA臨床表現主要涉及關節疼痛、腫脹、活動行走受限等方面，本研究結合患者上述臨床表現及膝關節平片Kellgren-Lawrence分級，對KOA組患者進行臨床評分，并將其分別與內側間室滑膜、髕上囊滑膜及外側間室滑膜中MMP-3表達強度進行相關性分析，內側間室及髕上囊滑膜MMP-3表達強度與臨床評分呈正相關關系(P=0.000)，據此可認為KOA患者臨床評分與膝滑膜病變程度可相互反映，應用MMP-3拮抗劑如四環素類抗生素、他汀類［19-20］等藥物，并聯合關節鏡下滑膜病變有限切除可緩解臨床癥狀、改善關節功能，亦能減緩炎性反應滑膜分泌至關節滑液中的炎性介質及MMP-3等軟骨溶解酶對于軟骨細胞外基質的破壞，進而減緩KOA的進展，對于存在疼痛癥狀的早期KOA患者以及主觀不愿行膝關節置換而選擇保守治療的晚期KOA患者，具有廣闊的臨床應用前景。

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