響應面法優化紅外制備高凝膠性血漿蛋白粉工藝

凌云霄　江城　鄭娟等

摘要：選取麥芽糊精作為羰基供體，采用紅外處理誘發血漿蛋白粉與麥芽糊精發生美拉德反應，從而提高血漿蛋白粉凝膠特性。首先以血漿蛋白粉的溶解性、凝膠性以及色差為檢測指標，通過單因素試驗研究了紅外處理時間、溫度以及麥芽糊精的添加量對血漿蛋白粉品質的影響，在單因素試驗基礎上，再采用響應面法優化血漿蛋白粉的加工工藝。結果表明：優化試驗的最佳條件為紅外溫度92℃，紅外時間17min，麥芽糊精添加量0.56%，測得其凝膠強度為175.52g/cm2，凝膠強度較對照組68.57g/cm2提高了1.56倍。

關鍵詞：血漿蛋白粉；凝膠性；紅外；響應面優化

中圖分類號：TS251.6 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2013）07-0020-06

血液進行分離和噴霧干燥后，可以得到血球蛋白粉和血漿蛋白粉，其中血漿蛋白粉蛋白含量高，氨基酸豐富平衡，是一種等同于全蛋粉的蛋白原料[1-3]。目前國內生產的血漿蛋白粉幾乎都是作為動物飼料使用的，而國外生產的血漿蛋白粉已經可以加入食品當中。相比而言，飼料級的血漿蛋白的應用價值不及食品用的血漿蛋白粉。而國產血漿蛋白粉凝膠性不足是導致其品質低于進口產品的一個重要因素。

國內外研究顯示，美拉德反應除了可以應用在食品風味還可以應用于接枝反應[4]。對于蛋白質易變性，難于改性的特點，美拉德接枝反應給科研人員提供了新的途徑。由于多糖在液相中能夠增稠和提高凝膠性，所以多糖的存在增加了膠體的穩定性。于是一些研究者致力于用多糖與蛋白質發生美拉德反應來改善蛋白質的熱不穩定性和其他功能特性[5]。因為血漿蛋白的研究與應用較晚，所以關于蛋白質與多糖的美拉德改性反應的研究大多局限于于蛋清粉、大豆分離蛋白等。早期研究表明：蛋清蛋白質與硫酸葡聚糖[6]、葡萄糖[7]、寡聚半乳糖醛酸[8]、半乳甘露聚糖[9]等糖類發生美拉德反應后，其凝膠性質均得到了很大的改善。

從理論上看，美拉德反應第1步為氨基與羰基的縮合生成席夫堿，第2步為席夫堿經過Amadori重排形成Amadori產物。因而血漿蛋白中豐富的氨基酸基團可以與大量的外源羰基（麥芽糊精）縮合發生美拉德反應，所以通過這個反應可以在血漿蛋白粉中引入多糖——麥芽糊精[10]，從而顯著增強血漿蛋白粉的凝膠性。但是美拉德反應第3步為裂解反應，理論上可起破壞此處的改性作用，因此，在實際反應過程中，反應進程的控制顯得非常重要。通過王玉堃等[11]、蘇丹等[12]、徐志軍等[13]的研究，可以發現紅外技術相比于干熱技術在處理效果和處理時間上都要好，所以用紅外處理方式引發美拉德反應為一個可行的研究方向。

本實驗以溶解性、凝膠性等為考察指標，通過紅外加熱使得血漿蛋白粉和麥芽糊精混合粉中的氨基與羰基發生美拉德縮合反應，采用響應面法優化出最佳的血漿蛋白粉加工工藝條件。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

冷凍血漿蛋白粉 湖北安陸寶迪肉類食品有限公司。

麥芽糊精（食品級） 上海西王淀粉集團；酒石酸鈉、硫酸銅、氫氧化鈉均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

B-290型小型噴霧干燥機 瑞士Büchi公司；AM-50型紅外烤箱 深圳市輝躍機械設備有限公司；721型可見光分光光度計 上海光譜儀器有限公司；TA-XT Plus物性分析儀 英國Stable Micro Systems公司；CT14RD臺式冷凍高速離心機 美國Beckman公司；HH-S恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；FA25高速乳化分散機 上海弗魯克流體機械制造有限公司；FA1104N型分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；WSC-S測色色差計 上海笛柏實驗有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶解度檢測

采用雙縮脲法，將1g豬血漿蛋白粉溶于蒸餾水，配成一定pH值（用1mol/L NaOH溶液和1mol/L HCl溶液調節）的溶液100mL（質量濃度10mg/mL），勻漿機攪拌1min，然后4000r/min離心10min，取上清液1mL，加蒸餾水至3mL，再加入3mL雙縮脲試劑，靜置30min后于540nm波長下測其吸光度，以蒸餾水為參比液。配制質量濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0mg/mL的牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液，在同樣條件下測其吸光度，繪制BSA溶液配制質量濃度與其吸光度的標準曲線，求出標準曲線的標準方程y=ax+b，其中y為BSA配制質量濃度，x為測得的吸光度。因為10mg/mL BSA百分百溶解，所以配制質量濃度為10mg/mL的血漿蛋白粉溶液的實際質量濃度（y）可以由標準方程求出，血漿蛋白粉的溶解度（Y）可由下式計算：Y/%= y/10×100[14]。

雙縮脲試劑的配制：將3g酒石酸鈉和0.75g硫酸銅溶于250mL蒸餾水。攪拌下緩慢加入150mL10% NaoH溶液，最后定容至500mL。

1.3.2 凝膠強度檢測

測試條件為：測試前速5mm/s，測試速度2mm/s，測試后速5mm/s，測試距離為15mm，夾具為直徑0.5英寸的圓柱狀平頭探頭，凝膠強度用硬度（Hardness）即探頭下壓過程中的最大感應力（g/cm2）表示[15]。

凝膠的制備方法：取2.25g蛋白粉放入50mL燒杯中→加入25mL蒸餾水→用高速均質機均質，靜置消泡→用保鮮膜封口，并用橡皮筋扎緊→置于80℃水浴加熱40min→立即放入冰水中冷卻20min→存放于4℃冰箱中過夜→恢復到室溫→測定凝膠強度。

1.3.3 色差檢測

開機預熱30min，校零。把待測的粉末放入測量皿壓實。用測色色差計探頭進行測量，平行測量3次取其平均值。

1.3.4 血漿蛋白粉制備工藝及步驟

因為新鮮血液無法長時間保鮮，為了保證實驗原材料的一致性，所以采用冷凍干燥制備的血漿蛋白粉復溶為濃縮血液，然后再進行改性實驗。血漿蛋白粉制備工藝如下：溶解血漿蛋白粉→添加麥芽糊精→過濾→噴霧干燥→稱量分裝→紅外改性→樣品檢測。

1）溶解血漿蛋白粉：按照10mL蒸餾水溶解1g血漿蛋白粉的比例配置血漿液；2）添加麥芽糊精：向血漿液中加入一定比例的麥芽糊精溶液并攪拌；3）過濾：使用濾布對血漿液進行過濾，除去其中的較大顆粒；4）噴霧干燥：將上述血漿液進行噴霧干燥，獲得噴霧干燥血漿蛋白粉；5）稱量分裝：根據單因素設置的不同水平試驗，對噴霧干燥血漿蛋白粉進行稱量分裝，確保每一水平實驗的蛋白粉質量基本相同；6）紅外改性：將分裝好的蛋白粉放入紅外烤箱中進行不同條件的紅外改性；7）樣品檢測：檢測改性后樣品的溶解度及凝膠性。

1.3.5 單因素試驗

1.3.5.1 紅外時間對血漿蛋白粉性質的影響

分別在紅外時間0、10、20、30、40、50、60、70min等條件下，固定麥芽糊精添加比例2%，紅外溫度90℃，研究紅外時間對血漿蛋白粉性質的影響，并檢測其溶解度、凝膠強度和色差。

1.3.5.2 麥芽糊精添加量對血漿蛋白粉性質的影響

固定紅外時間為1.3.5.1節中的最優時間，紅外溫度90℃，研究麥芽糊精添加量對血漿蛋白粉性質的影響。添加水平為：0.00%、0.25%、0.50%、1.00%、2.00%、4.00%。

1.3.5.3 紅外溫度對血漿蛋白粉性質的影響

固定紅外時間為1.3.5.1節中的最優時間，麥芽糊精添加比例為1.3.5.2節中的最佳添加比例，研究紅外溫度對血漿蛋白粉性質的影響。溫度水平為：0（未紅外處理）、70、80、90、100、110℃。

1.3.6 響應面試驗

通過單因素試驗，得出各因素最優水平，以凝膠性最為響應值，對紅外時間，紅外溫度與麥芽糊精添加量3個因素設計試驗，使用Design Expert8.05軟件進行3因素3水平響應面試驗。

2 結果與分析

2.1 BSA標準側曲線的測定與繪制

以1.0mg/mL為質量濃度梯度，10mg/mL為最大質量濃度，依次配置10個不同質量濃度的BSA溶液。每組設置3個平行進行吸光度測定。以每組3個平行測定的吸光度的平均值為x軸，以BSA質量濃度為y軸來繪制BSA標準曲線。

由圖1可知，隨著BSA質量濃度的增加，相應的吸光度也在增加，并且兩者有著線性關系。根據相關數據由Excel軟件程序可以計算出其標準曲線，求解出標準方程為y=25.871x-0.8073，其中y為BSA質量濃度，x為測得的吸光度。標準方程的相關系數為0.9985，所以可以使用。

2.2 紅外時間對血漿蛋白粉的影響

2.2.1 紅外時間對血漿蛋白粉溶解度的影響

由圖2可知，隨著紅外時間的延長，血漿蛋白的溶解度先上升后下降，在60min以前其改性后的溶解度都高于原始樣，并且在20min時達到最高值，隨后逐漸下降，尤其是是紅外時間超過60min之后，改性后的血漿蛋白粉的溶解度急速下降，這可能是紅外時間加熱過長之后血漿蛋白變性造成的，因為血漿蛋白的變性溫度就在70～80℃之間。根據數據分析（F檢驗）顯示，紅外時間對血漿蛋白粉的溶解度影響顯著。

2.2.2 紅外時間對血漿蛋白粉色澤的影響

紅外時間對血漿蛋白粉色澤的影響試驗結果如圖3所示。其中L值表示亮度，B值表示黃度。

由圖3可知，雖然數據變動幅度很小，但是趨勢很明顯。隨著紅外時間的延長，血漿蛋白粉的亮度值緩慢減小，而其黃度值緩慢變大。這是因為隨著時間的加長，美拉德反應的第3步反應產物越來越多，導致血漿蛋白粉的亮度下降，黃度增加。根據數據分析（F檢驗）顯示，紅外時間對血漿蛋白粉的亮度與黃度影響顯著。

2.2.3 紅外時間對血漿蛋白粉凝膠性的影響

由圖4可知，隨著紅外時間的延長，血漿蛋白粉的凝膠性先升高后下降，在20min時取得峰值。當紅外時間超過60min后，其凝膠強度會低于原始樣的凝膠強度，可見紅外時間過長時會對血漿蛋白粉起到負面作用的。根據數據分析（F檢驗）顯示，紅外時間對血漿蛋白粉的凝膠性影響顯著。

由圖2～4可知，紅外時間為20min時對血漿蛋白粉的改性效果較優，所以后續單因素試驗紅外時間固定為20min。

2.3 麥芽糊精添加量對血漿蛋白粉的影響

2.3.1 麥芽糊精添加量對血漿蛋白粉溶解度的影響

由圖5可知，隨著麥芽糊精添加量的增加血漿蛋白粉的溶解度先增加后降低，在添加比例達到0.5%時出現峰值。當麥芽糊精添加量超過1.0%后，血漿蛋白粉的溶解度會迅速下降并且低于原始樣。這可能的原因是美拉德反應進入了第3步。根據數據分析（F檢驗）顯示，麥芽糊精添加量對血漿蛋白粉的溶解度影響顯著。

圖5與圖2對比分析，圖5中麥芽糊精添加量為0.00%的血漿蛋白粉的溶解度為94.02%，圖2中紅外時間為0min的血漿蛋白粉的溶解度為85.32%，所以不加麥芽糊精紅外處理后的血漿蛋白粉比添加麥芽糊精而不紅外處理的血漿蛋白粉的溶解度好，可以推測麥芽糊精對血漿蛋白粉溶解度的影響與美拉德反應有關。

2.3.2 麥芽糊精添加量對血漿蛋白粉色澤的影響

從圖6可知，隨著麥芽糊精添加量的增加，血漿蛋白粉的亮度與黃度值會出現小范圍的改變。亮度值先增加后下降，在添加量為0.5%時取得最大值，而黃度值則是一直增加。因為美拉德反應的第3步是最終的反應，所以增加黃度的美拉德反應產物會不斷的積聚，所以黃度值會一直增加。而其亮度的波動，應該是因為反應底物濃度（羰基）在臨界點附近的改變而造成的。根據數據分析（F檢驗）顯示，麥芽糊精添加量對血漿蛋白粉的亮度與黃度影響顯著。

2.3.3 麥芽糊精添加量對血漿蛋白粉凝膠性的影響

由圖7可知，隨著麥芽糊精添加量的增加，血漿蛋白粉的凝膠強度先上升后下降，在添加量為0.5%時取得極值。而當麥芽糊精的添加量達到4%時，其改性血漿蛋白粉的凝膠強度將低于原始樣的凝膠強度。可見麥芽糊精添加量過大會起到負面作用。根據數據分析（F檢驗）顯示，麥芽糊精添加量對血漿蛋白粉的凝膠性影響顯著。

由圖5～7可知，麥芽糊精添加量為0.5%時對血漿蛋白粉的改性效果較優，所以后面的單因素試驗麥芽糊精添加量固定為0.5%。

2.4 紅外溫度對血漿蛋白粉的影響

2.4.1 紅外溫度對血漿蛋白粉溶解度的影響

由圖8可知，隨著紅外溫度的增加，血漿蛋白粉的溶解度會出現2個波峰，但是在110℃以內，紅外處理的血漿蛋白粉和原始樣對比溶解度都是提高的。由試驗數據可知，在紅外處理溫度為100℃時，血漿蛋白粉的溶解度有最高值，為95.24%。根據數據分析（F檢驗）顯示，紅外溫度對血漿蛋白粉的溶解度影響顯著。

2.4.2 紅外溫度對血漿蛋白粉色澤的影響

由圖9可知，隨著紅外溫度的改變，血漿蛋白粉的亮度與黃度會出現小幅度的改變，其中亮度緩慢減小，黃度緩慢增加，這個趨勢與圖5類似，都是由于美拉德反應進程而改變的。根據數據分析（F檢驗）顯示，紅外溫度對血漿蛋白粉的亮度與黃度影響顯著。

由圖3、6、9可知，紅外改性對血漿蛋白粉的影響趨勢為亮度減小、黃度增大，并且變化幅度很小。這是由于美拉德反應的最終產物包含褐變物質，而褐變必然要降低其亮度，增加其黃度，所以色差對改性血漿蛋白的性質評價意義也不大。但是在考察麥芽糊精添加量時，得到的臨界值0.5%周圍數值有一定參考意義。

2.4.3 紅外溫度對血漿蛋白粉凝膠性的影響

由圖10可知，隨著紅外溫度的加大，血漿蛋白粉的凝膠強度先增大后減小。在90℃時達到最大值，而當紅外溫度大于100℃后，其凝膠強度將會低于原始樣的凝膠強度。這是美拉德反應由第3步占據主導地位后導致的。根據數據分析（F檢驗）顯示，紅外溫度對血漿蛋白粉的凝膠性影響顯著。

由圖8～10可知，紅外溫度對血漿蛋白粉的色差影響不大；在100℃時其溶解度最大，但是前后溶解度差值很小；在90℃時其凝膠強度最大，并且前后測量值的差值很大。所以選取90℃為最佳紅外溫度。

由3個單因素試驗可知，美拉德反應的前期是可以起到改善作用的，但是到了反應中期以后就會產生負面作用。3個單因素試驗得到的最優條件紅外時間20min、麥芽糊精添加量0.5%、紅外溫度90℃。雖然3個單因素試驗都顯著，但是因為其實際計算得到的溶解度除時間因素之外都是波動在0.05以內，原因可能為未變性的血漿蛋白粉溶解度很高，所以紅外改性對于血漿蛋白粉的溶解度的優化作用相對較小[7]，因此溶解度不能成為評判改性效果的主要因素。又因為2.4.2節分析得出結論：色差對改性血漿蛋白的性質評價意義也不大，所以將凝膠強度作為后續響應面試驗考察的唯一指標。

2.5 響應面結果與分析

利用Design-Expert8.0軟件，對表1試驗數據進行回歸分析，得到溫度（A）、時間（B）、麥芽糊精添加量（C）的二次回歸方程為：

凝膠強度/（g/cm2）=―1982.62491+41.59953A+20.40346B+245.78780C―0.13285AB―0.83909AC―5.01747BC―0.21085A2―0.16003B2―75.49142C2

該模型的方差分析結果見表2。

由表1、2可知，紅外溫度P<0.05，紅外時間P>0.05，麥芽糊精添加量P>0.05。說明紅外溫度對凝膠性的影響顯著，而紅外時間和麥芽糊精添加量的影響相對較小，則各因素影響凝膠性的大小順序為：紅外溫度>紅外時間>麥芽糊精添加量。失擬項不顯著即該模型在整個研究回歸區域擬合的較好。

由響應面軟件運算得到的推薦條件為：紅外溫度92.29℃，紅外時間16.62min，麥芽糊精添加量0.56%，推導出的凝膠強度為175.759g/cm2。實際操作將工藝條件修正為：紅外溫度92℃，紅外時間17min，麥芽糊精添加量0.56%。驗證實驗結果表明：在紅外溫度93℃、紅外時間17min、麥芽糊精添加量0.56%時，測得其凝膠強度為175.52g/cm2，基本吻合。

3 結 論

3.1 紅外能夠改善血漿蛋白粉的性質，其對改性血漿蛋白粉的溶解度和凝膠性有的改善作用，但是時間過長后會起負面影響，其對于血漿蛋白粉的色差影響不大。當紅外時間為20min時，改性血漿蛋白粉的溶解度與凝膠性都取得最好值。

3.2 隨著麥芽糊精的添加比例的增加，其對改性血漿蛋白粉的溶解度、色差、凝膠性的影響都是先升高后降低，當麥芽糊精添加比例為0.5%時，改性血漿蛋白粉的溶解度，亮度與凝膠性都會取到最優值。

3.3 當紅外溫度為100℃時，改性血漿蛋白粉的溶解度最好。但當紅外溫度為90℃時，改性血漿蛋白粉的凝膠性最好。由于改性血漿蛋白粉的溶解度隨著紅外溫度的變化波動在0.05以內，而紅外溫度對于改性血漿蛋白粉的凝膠性的改變波動很大，所以參考下還是選擇90℃為最優單因素溫度條件。

3.4 通過響應面優化試驗，推導出最優紅外改性工藝條件，并通過驗證實驗進行驗證。得出的最優條件為紅外溫度92℃、紅外時間17min、麥芽糊精添加量0.56%，在此最佳條件下，血漿蛋白粉的凝膠值為175.52g/cm2，凝膠強度較對照組68.57g/cm2提高了1.56倍。

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