一種簡單高效的水稻體細胞誘變育種新方法

林建中　楊遠柱　周波　符辰建　杜長青　胡小淳

摘要：多樣化種質資源的利用對于培育高產和理想農藝性狀水稻品種顯得非常重要.在本研究中，通過研究繼代時間、2，4D濃度和不同外植體對誘變和分化頻率的影響，建立了幼穗為外植體、繼代培養時間為3個周期（約75 d）以及2，4D的最佳誘變濃度為4.0 mg/L的體細胞誘變育種方法.然后利用該方法誘變雜交水稻親本株1S和中9B，分別成功選育了優良矮化突變株系SV14S和SV9B，為后續的雜交育種提供了優質種質資源.這些育種成果的取得進一步證實了該水稻體細胞誘變育種方法是一種簡單高效的新型育種方法.

關鍵詞：突變；水稻（Oryza sativa L.）； 組織培養； 2，4D； 育種

中圖分類號：S336 文獻標識碼：A

水稻（Oryza sativa L.）是世界上重要的經濟谷類作物，有超過一半的世界人口以大米作為主食.然而，隨著人口的不斷增長和耕地的減少，據估計到2030年大米的需求將比現在提高40%_[1].因此，很有必要通過各種育種方法以提高水稻產量.

育種是一個從大量株系中篩選出理想表型株系的過程，這些大量的株系一般來源于自然和人工突變以及雜交重組.因突變可能產生的優良種質是育種的一個重要來源.多樣化的種質資源對水稻育種非常重要，如提高產量以及其他農藝性狀的改良等[2-3].然而，優良品種的篩選需要大量原始育種材料，因而采用新的方法來獲得大量多樣化的候選株系就顯得非常重要.體細胞無性系變異作為一個新的變異來源，引起了遺傳學家和育種學家的大量關注_[4].許多作物包括玉米和水稻_[5]等已被用于組織培養和體細胞無性系變異研究_[5-7]，為作物育種提供了一種新的誘變途徑.體細胞的誘導突變能夠獲得相當豐富的遺傳變異，又因其容易應用和推廣而具有很高的實用價值[8-9].突變體因染色體數目改變、點突變、結構性染色體重排等原因而引起表型改變，而且該表型還可以穩定遺傳.因此，以此為基礎可以培育新的作物優良品種.

體外培養誘導突變所涉及的因素包括培養基的成分（各種鹽類、激素和有機物質等）和培養條件（溫度、光照和培養時間等）_[10].誘變造成組織培養細胞的突變可能是一個或多個誘變因素.迄今，在水稻誘變育種方面還未見以高濃度2，4D為誘變劑的誘變育種方法的報道.在本研究中，我們分別研究了繼代培養時間、2，4D濃度和不同外植體對突變頻率的影響，建立了一種以幼穗為外植體和4.0 mg/ L 2，4D誘變處理的水稻體細胞無性系誘變育種方法.同時，利用該誘變方法從水稻品種株1S和中9B中分別成功選育了2個穩定的優良矮稈突變株系SV14S 和 SV9B，并進一步證實了該水稻體細胞誘變育種方法的有效性.

1材料與方法

1.1實驗材料

本研究所用的植物材料為4個秈稻品種株1S，中9B，316B和R527，均為華南地區的雜交水稻骨干親本.株1S為湖南省株州市農科所培育的秈型光溫敏核不育水稻 [11]

1.2.5不同外植體對誘變頻率的影響

分別選取株1S的幼穗、幼胚和成熟胚作為外植體誘導愈傷組織.先繼代1個周期，然后在4.0 mg/L 2，4D的MS培養基上誘變1個周期.其后的步驟與2，4D濃度對誘變頻率影響的實驗方法相同.最后分別統計3種外植體對誘變頻率的影響.

1.2.6矮稈突變體的篩選和表型鑒定

具體方法參照我們先前發表的一篇論文_[14]，主要于R2代考查其株高性狀，并觀察其性狀分離情況.對于比原親本水稻株高有所降低而且能穩定遺傳的突變株系，于抽穗期套袋使其自交結實和采收種子（R3），同時考察和評價其農藝性狀.對符合目標性狀且穩定遺傳的變異株即為優良誘變品種（系）.

1.2.7莖的單位長度干物質含量分析

于成熟期分別隨機選擇株1S和SV14S各20株，先測量整個莖稈的長度，然后將各節間分開，分別測量各節間長度.將各節間再置于50 °C烘箱烘烤16 h，于分析天平稱取各節間重量.最后，根據所得的數據，計算整個莖稈和各節間重量（mg）/長度（cm）的比值.另外，統計突變株系SV14S的重量（mg）/長度（cm）比值的增加率.其計算公式為：增加率=[SV14S的比值（mg/cm）-株1S的比值（mg/cm）]/株1S的比值（mg/cm）×100%.

2結果與討論

2.1繼代時間對植株再生的影響

已有研究發現_[15]，組織培養的體細胞變異頻率隨培養時間的延長而提高.但是隨著培養時間的延長，其愈傷組織的分化頻率也急劇下降，往往導致再生苗分化的極度困難.因此，我們首先研究了繼代時間對植株再生的影響，以尋找愈傷組織的最佳繼代時間.以25 d為一個培養周期，挑取剛從株1S幼穗誘導出來的顏色淡黃、質地致密的胚性愈傷組織于繼代培養基進行繼代培養，分別繼代0～9個周期，然后轉接到分化培養基上觀察并統計分化頻率.其中，繼代0周期的胚性愈傷組織即為剛從幼穗誘導出來的胚性愈傷組織轉接到分化培養基.實驗結果發現，當繼代4個周期以上，其愈傷組織的分化頻率急劇下降，由繼代3個周期時的59.0%急降至15.8%左右（圖2（a））.因此，為了保持較高的分化頻率和變異頻率（由繼代時間決定），我們認為在高濃度2，4D誘變處理前的最佳繼代時間為3個周期.

2.3不同外植體對誘變頻率的影響

在水稻組織培養中，一般選用幼穗、幼胚和成熟胚作為外植體_[13，16-17].在3種外植體中，究竟哪種最適合作為體細胞無性系變異的外植體呢？迄今還未見相關研究內容的文獻報道.于是我們研究了水稻幼穗、幼胚和成熟胚等3種外植體對誘變頻率的影響.研究結果發現，由幼穗誘導的愈傷組織的誘變頻率達到了24.7%，由幼胚誘導的為5.2%，而由成熟胚誘導的僅為3.8% （圖2（c））.在單一性狀的變異方面，由幼穗誘導的愈傷組織的誘變頻率也很高.如由株1S幼穗誘導、誘變和再分化得到的500株分化苗中，經在海南陵水基地的表型鑒定，發現共有24株表現出株高不同程度的矮化.就株高性狀的變化來說，其突變率達到了4.8% （24/500）（表2）.而由成熟胚誘導的愈傷組織經誘變和再分化后得到的分化苗中，幾乎沒有發現矮化突變株（結果未列出）.由此可以看出，在體細胞無性系誘變的外植體中，幼穗明顯優于幼胚和成熟胚.其可能的原因是處于花粉母細胞形成時期的水稻細胞在離體培養條件下對外界環境更敏感，更易發生變異.另外，幼穗作為外植體還有具有愈傷組織誘導率高和活力強等優勢（結果未列出）.因此，體細胞無性系誘變育種的最佳外植體為幼穗.

2.4不同品種的體細胞突變頻率的分析

通過上面以株1S為材料進行的繼代時間、2，4D濃度和不同外植體對誘變和分化頻率的影響，初步建立了以幼穗為外植體，以4.0 mg/L 2，4D為最佳誘變濃度的體細胞無性系誘變方法.為了進一步驗證該方法的有效性，我們對包括株1S在內的水稻品種中9B，R527和316B等進行了無性系誘變.為了實驗的準確性，僅以單一性狀的突變進行統計分析.在生產中，株1S，中9B和R527的株高偏高，導致所配組合抗倒伏性差，而316B的種子穎殼閉合度差，容易導致種子霉變和發芽率降低.因此，在株1S，中9B和R527中，以矮稈或半矮稈突變株系進行統計分析，而316B則以種子穎殼閉合度好的突變株系進行統計分析.實驗結果發現，誘變頻率最高的是株1S，在500株分化苗中共得到了24個矮化變異株系，其誘變頻率達到了4.8% （24/500）.誘變效率最低的是316B，在236株分化苗中僅得到了1個種子穎殼閉合度較好的突變株系，其誘變頻率僅為0.42% （1/236）.中9B和R527分別為2.33%和1.42% （表2）.由此說明，體細胞無性系的突變率還取決于品種間的基因型差異.

2.5矮稈突變株系的表型分析

在株1S的24個SV矮化突變株系中，選取了SV5S，SV10S和SV14S等3個綜合農藝性狀較優的變異株系，對它們的株高和各節間長度進行了分析.由于在不育狀態時不育系水稻的穗不能完全從旗葉的葉鞘中伸展出來，對植株高度的測量產生很大的影響[18-19].因此，親本株1S和其SV突變體（R3）都是經20 ℃低溫處理使其育性恢復后于成熟期測量株高及節間長度（表3）.從表中的統計結果可知，在株高上出現株1S，SV10S，SV14S和SV5S依次變矮的順序，其節間特別是基部的節間明顯縮短，而穗長卻縮短幅度很小.該結果說明，矮化突變體能顯著提高抗倒伏性.通過進一步綜合農藝性狀的鑒定和評價，發現SV14S的各種農藝性狀更加優良_[13].于是我們檢測了株1S和SV14S各節間及整個莖稈的單位長度干物質含量，以進一步研究SV14S的抗倒伏能力.實驗結果發現，除了第一節間外，SV14S其它節間的單位長度干物質含量均比親本株1S高（表4）.該結果說明，突變體SV14S既能增加抗倒伏性，又能提高產量.雜交配組實驗也進一步說明了SV14S的優良抗倒伏性能.如SV14S與恢復系912的雜種后代（F1）的抗倒伏性明顯優于株1S與912的雜種后代（結果未列出）.因此，突變株系SV14S在雜交水稻育種中具有良好的應用前景.另外，我們還對突變株系SV14S進行了相關分子生物學分析，并在基因水平上證明該突變體確實發生了穩定變異，具體結果見先前發表的相關文章_{[14， 20-21]}.

在中9B的5個SV矮化突變株系中，經過3～4代的考察和評價，選取了其中綜合農藝性狀最優的矮化株系命名為SV9B，并對其農藝性狀進行了考察和評價.圖3顯示了SV9B和對照親本中9B的植株形態、株高和各節間長度.從圖可知，中9B和SV9B的植株高度分別為93 cm和75 cm， SV9B的株高明顯低于對照親本中9B（圖3（a）和（b）），而且SV9B的各節間均縮短，其中基部節間長度縮短明顯，而上部節間長度縮短幅度較小（圖3（c）和（d））.特別是SV9B的III節間的縮短幅度最大，還不到中9B的III節間長度的一半.另外，我們還測量了中9B和SV9B成熟穗的農藝性狀（圖4和表5），發現與對照親本中9B相比，SV9B的穗長幾乎沒有變化，初級小穗數和千粒重稍微降低，而次級小穗數和每穗粒數卻顯著增加.同時，SV9B的種子比中9B的種子更加飽滿（圖4（c））.這些結果說明，突變體SV9B不僅增加了抗倒伏性，而且提高了單株產量，具有良好的應用前景.

優良矮稈突變株系SV14S和SV9B的成功選育為后續的傳統雜交育種提供了優質種質資源.隨后，以SV14S與優質抗稻瘟病父本ZR02雜交，通過“人工低溫與自然低溫雙重壓力選擇”和定向培育，育成優質兩用核不育系湘陵628S （品種授權號：CNA20070803.1）.用該親本選配的雜交組合在國家和湖南省區試評比中農藝性狀表現優異（結果未列出），已獲準大面積商業推廣.如超級雜交早稻組合陵兩優268，兩年國家區試第一名，已通過國家審定.同樣，利用SV9B與三系胞質不育系T98A測交、多代回交選育出抗倒伏的優質三系胞質不育系SV916A，利用該親本選育的優質超級雜交稻組合即將應用于生產.總之，這些卓有成效的育種成果的取得進一步證實，利用幼穗為外植體和2，4D為誘變劑的水稻體細胞誘變育種方法是一種簡單有效的新型育種方法.同時也說明，在整個誘變和后續的選育過程中，如果結合一定的選擇壓力可以有效加快育種進程.

3 結論

在本研究中，通過研究繼代時間、2，4D濃度和不同外植體對誘變和分化頻率的影響，初步建立了以幼穗為外植體、誘變前繼代培養時間為3個周期（約75 d）以及以4.0 mg/L 2，4D為最佳誘變濃度的體細胞誘變育種方法.同時，利用該方法誘變株1S和中9B，分別成功選育到了優良矮化突變株系SV14S和SV9B，為后續的傳統雜交育種提供了優質種質資源.這些育種成果的取得進一步證實了該水稻體細胞誘變育種方法是一種簡單有效的新型育種方法.

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