淺析基因定點誘變在蛋白質工程中的應用

胡文斌　朱云波

在蛋白質工程中對蛋白質結構進行的設計改造，最終還必須通過基因來完成。設計改造后的蛋白質在自然界生物中不存在相應的基因，往往需要通過人工化學合成或基因修飾獲得，其中基因修飾的主要方法就是基因定點誘變。如在高中生物人教版選修3教科書“蛋白質工程的崛起”這一節中談到：“將天冬氨酸激酶的第352位的蘇氨酸變成異亮氨酸，將二氫吡啶二羧酸合成酶中104位的天冬酰胺變成異亮氨酸，就可以使玉米葉片和種子中的游離賴氨酸分別提高5倍和2倍。”這個實例中，改造后的蛋白質基因與原始基因只有一個堿基對的差異，其所用的方法就是基因定點誘變。但是，基因突變往往是不定向的，是隨機的，研究者如何讓基因按照人的意愿進行定向突變呢？為什么沒有用化學合成法合成基因呢？化學合成法有什么弊端嗎？下面就這些問題作簡要分析和闡述。

1 基因定點誘變的原理和方法

基因定點誘變技術是蛋白質工程研究中的一種重要方法，其實質是利用化學合成寡核苷酸和基因重組技術相結合的方法，按照預定設計，對已知基因的特定堿基進行定點增刪或轉換，最終改變對應的氨基酸序列和蛋白質結構。最具代表性的定點誘變方法有以下三種。

1.1 寡核苷酸介導的定點誘變

利用人工合成的寡核苷酸可以制造任何部位的突變，而不受限制酶切點的限制（圖1）。如果希望改變某個DNA的某個特定堿基，可以先合成一條突變堿基位于中間的寡核苷酸，一般長度約15～20 bp。這條寡核苷酸鏈除了突變堿基外，其余的序列與野生型DNA分子中的相應序列完全一致。然后將合成的寡核苷酸與由單鏈噬菌體做載體所攜帶的DNA克隆互補鏈混合，進行分子雜交。這段配對的寡核苷酸可以做為引物，在DNA聚合酶作用下合成完整的互補鏈，再用DNA連接酶連接起來。將此雙鏈DNA導入大腸桿菌中，經擴增就可以得到大量可穩定遺傳的的突變DNA克隆。

1.2 盒式定點誘變

盒式定點誘變是利用一段人工合成的含有突變序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中相應序列。其中，合成的DNA片段稱為“盒”。通常的做法是：先制備好含有正常目的基因的重組質粒，然后在目的基因需要突變的部位附近找兩個限制酶位點，利用合適的限制酶將二者之間的DNA序列切掉，而由一段人工合成含有突變堿基的雙鏈DNA片段通過DNA連接酶連接取代，從而達到基因定點突變的目的。此法的缺點在于突變區段的兩側需存在一對限制酶位點，限制了該方法的廣泛應用。

1.3 PCR介導的定點誘變

任何基因，只要知道兩端及需要變異部位的序列，就可用PCR誘變去改造該基因序列。由于方法簡便易行，結果準確高效，因此PCR介導的定點誘變已成為最常用的方法。

PCR定點誘變有兩種情況。① 變異部位位于基因的末端。這種情況只需在人工合成5'端或3'端引物時引入變異堿基，便可使PCR產物（目的基因）的末端引入變異。② 變異部位位于基因的中間。這種情況需要借助重組PCR方法，可在DNA任意部位產生定點誘變（圖2）。首先在需要誘變的位置合成含有變異堿基的互補引物（引物b和c），然后分別與3'引物（引物a）和5'引物（引物d）進行PCR，這樣便可得到兩個PCR產物分別含有變異堿基，由于二者中間有一段序列彼此互補重疊，在重疊部位經重組PCR就能得到基因的中間含變異堿基PCR產物。重組PCR不僅可在基因任意位點引入變異，還可在不同基因片段之間發生重組連接。

2 化學合成法的局限性

DNA的化學法合成不需要模板，在蛋白質改造中可以依據研究人員設計的核苷酸序列直接合成基因。那么為什么不都用化學方法直接合成突變基因呢？這是由于化學法合成DNA的缺陷造成的。首先，化學合成的是單鏈，這個問題可通過合成互補鏈退火來部分解決。其次，在化學合成中不能保證前一步產物能100%延長到下一步的產物，隨著長度的延長，產物合成率下降，而且這些非全長的序列需除去以免影響后續應用。最后，在寡核苷酸的合成中也會出現大量的錯誤，而且出錯誤率隨長度增加而增加。對于較長的基因往往需要分成若干小的片段進行合成，然后經拼接才能得到完整的基因，這使得基因制備難度加大，并且費用相對比較昂貴，從而導致化學合成法的應用具有一定的局限性。

從上述可以看到，定點突變技術在蛋白質工程中具有重要應用價值。自1982年Zoller和Smith發表寡核苷酸介導的定點突變方法以來，通過不斷發展和創新，定點突變技術已經成為研究蛋白質結構和功能之間的復雜關系的有力工具，也是實驗室中改造、優化基因常用的手段，其應用領域非常廣泛，在研究蛋白質相互作用位點的結構、改造酶的活性或者動力學特性，提高蛋白的抗原性或穩定性，改造啟動子或DNA作用元件，以及藥物研發、基因治療等方面都有非常重要的應用。

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