誘導性多能干細胞的研究進展和前景展望

張又文　寸湘竹　張可夫等

組織工程是應用工程學及生命科學原理和方法，實現組織保存、修復、功能維持和提高作用的生物學替代物的科學，目的是實現組織器官的功能修復。干細胞不僅可用于再生醫學、組織工程，還可應用于生物生長發育機制的研究、藥物篩選、基因治療等領域。因核移植技術以及提取胚胎干細胞面臨著材料不易獲取、免疫排斥和倫理學爭議，其研究發展受限。誘導性多能干細胞（induced Pluripotent stem cells，iPSC）是將影響全能性的外源轉錄因子基因導入分化的體細胞誘導其重編程成為類似于胚胎干細胞（Embryonic stem cells，ESC）的多能干細胞。iPSC制備技術不需要胚胎和卵母細胞，克服了以上限制，應用前景廣闊。

1 誘導性多能干細胞的產生

2006年，Takahashi等[1]將24種與全能性相關的轉錄因子排列組合，利用逆轉錄病毒載體導入小鼠成纖維細胞，并通過Fbxl5報告基因（細胞多能性標志分子）篩選，確定了4種轉錄因子Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4可將成纖維細胞重編程為iPSC，其在細胞形態、基因和蛋白表達、生長特性、標志物等方面與小鼠ESC十分相似。這些iPSC能形成畸胎瘤和嵌合體小鼠胚胎，但是不能形成成活嵌合體小鼠并參與到生殖遺傳。后來，Okita等[2]改選Nanog進行篩選建立的iPS細胞系相比Fbx15篩選得到的iPSC在基因表達譜和DNA甲基化模式上與ESC更接近，且能夠參與成活的嵌合體小鼠生殖系細胞的遺傳。2007年，Takahashi等[3]建立了人iPSC，美國Thomson實驗室[4]同時報道通過慢病毒轉導Oct4，Sox2，Nanog及Lin28四個基因也能將新生兒包皮成纖維母細胞成功重編程為iPSC。隨后，多種來源體細胞都被重編程為iPSC。

2 iPS細胞制備技術的優化

2.1轉錄因子的選擇：選擇轉錄的除了由其本身的全能性決定外，還可根據加入的小分子化合物和體細胞內源性轉錄因子表達水平等多方面綜合考慮進行優化。Kim等[5]發現Oct4是必需的，外源Sox2、Klf4 和c-Myc 表達不是iPSC產生的必要條件，其作用是提高誘導效率。增加轉錄因子使用個數，如：采用六因子（Oct4，Nanog，Sox2，Lin28，c-Myc和Klf4）可顯著提高重編程效率[6]，然而轉錄因子作為外源基因對iPSC的安全也構成了威脅。小分子化合物可替代某些轉錄因子并提高重編程效率，其機制可能是小分子化合物誘導內源性轉錄因子的表達，因此有利于安全性的提高。Huangfu等[7]在對組蛋白脫乙酰基酶抑制劑-丙戊酸（VPA）的一系列研究發現，利用VPA可以使只有Oct4、Sox2轉錄因子的體細胞成功誘導為iPSC。對于小分子化合物的研究加深了對重編程的信號通路和分子機制的研究，使我們能更好地理解體細胞重編程機制。研究已發現有效的小分子化合物還有Vit C、PD0325901、CHIR99021、P53 siRNA和UTF1等，均可提高iPSC產生效率。

2.2外源因子導入方式：逆轉錄病毒是首次產生iPSC所使用的載體，以逆轉錄病毒和慢病毒為載體的轉染方式會使外源基因和載體序列整合。多病毒整合位點引起的插入突變會干擾正常基因功能，而外源基因的表達會影響細胞分化，導致腫瘤發生。2008年，Stadtfeld等[8]和Okita等[9]分別使用腺病毒和質粒來瞬時轉染細胞，成功獲得無外源基因整合的iPS細胞，但誘導效率低下。2009年，研究者[10-12]利用Cre/LoxP 重組系統，oriP/EBNA1質粒和piggy-Bac轉座子系統將外源基因從iPS細胞中切除，這些方法較為繁瑣，安全性也有待驗證。直接導入轉錄因子蛋白或mRNA，被認為是最安全的方法，在重編程因子蛋白上連接細胞穿膜肽組成融合蛋白，可穿透細胞膜進入細胞內部，執行其重編程的功能，蛋白誘導小鼠和人體的iPSC都已實驗成功[13]。但是其誘導效率低，且蛋白容易失活。Warren等[14]將4個產生重編程蛋白的mRNA導入細胞以誘導iPS細胞，這種方法效率較高，誘導時間也只需原來的一半。

2.3 體細胞的選擇：不同分化階段的體細胞，在重編程的難易程度、效率、所需因子組合或克隆形成所需時間等方面上是不同的。分化程度低的體細胞，如：神經干細胞、間充質干細胞，其重編程大大易于終末分化的體細胞。同時有研究顯示不同來源的iPSC在腫瘤形成上存在很大差異。Aoi等[15]發現成纖維細胞來源的iPSC成瘤性比肝臟細胞和胃表皮細胞來源的iPSC成瘤性要高很多。Sun等[16]發現采用人脂肪干細胞作為供體細胞，效率是皮膚成纖維細胞的20倍，原因可能是脂肪干細胞內源性轉錄因子的高表達。也有研究[17]采用血細胞來獲得iPS細胞，使得其產生方式更為便捷。此外，Yoshida等[18]發現5%低氧濃度的細胞培養環境可有效提高iPSCs的誘導效率。隨著對多種體細胞重編程及其機制的研究，將有望找到兼具高效、安全、易于取材等優點的供體細胞。

2.4 iPSC的篩選鑒定：從最開始的Fbx15到選用Nanog或Oct4篩選出與ESC更類似的iPSC，報告基因篩選法都需要對細胞進行遺傳學修飾。后來，Maherali等[19]利用形態學標準來篩選鑒定，然而形態學的篩選工作量大，需要研究者豐富的ESC培養經驗。現在一般從形態學、分子和功能水平上進行系統地篩選鑒定。在功能上主要是形成畸胎瘤、形成嵌合體、擁有生殖系遺傳能力以及產生四倍體能力的鑒定，然而除了畸胎瘤生成，其余鑒定方式都面臨倫理問題，不方便應用于人類iPSC。

3 iPSC的應用

構建人類疾病的動物模型，用于細胞替代治療的研究。2007年，Hanna等[20]利用人類鐮狀細胞性貧血的小鼠動物模型，取尾尖成纖維細胞重編程為iPSC，然后通過同源重組的方法用人野生型βA-珠蛋白基因替代了βS- 珠蛋白基因，接著將修飾過的iPSC定向分化為造血干細胞，移植后治療動物模型的鐮狀細胞性貧血。美國學者Wernig等[21]將體外誘導分化的神經前體細胞移植進人小鼠胎腦，形成的神經膠質細胞和神經元細胞具有良好的功能和活性，進一步研究證明移植體外分化的多巴胺能神經元可以明顯改善成年帕金森病模型鼠的運動功能。Xu等[22]用iPSC分化而來的內皮前體細胞移植入血友病A的模型小鼠肝臟中，有效改善了出血不止的癥狀。此外還有多項研究將iPSC在體外定向分化為原始生殖細胞、胰腺細胞、β細胞、心肌細胞等。這都顯示了極大的臨床應用價值。

此外，人類疾病特異性iPS細胞系的建立，為個性化的治療提供了可能。2008年，Dimos等[23]將一患有家族性肌萎縮側索硬化（ALS）的82歲患者的皮膚成纖維細胞成功誘導成iPSC，并分化成帶有疾病特征的運動神經元，該模型的建立可以研究ALS的發病機制，提供尋找合適藥物靶點，篩選治療ALS的藥物，還可能用于通過遺傳修飾得到正常功能的自體神經元進行移植治療。Park等[24]也建立了多種遺傳病患者的特異性的iPS細胞系包括脊髓性肌萎縮（SMA），亨廷頓病，唐氏綜合癥等。

4 iPS細胞的問題與展望

目前，提高iPS細胞的誘導效率和安全性以使其應用于臨床醫療是當前研究的熱點，同時iPS細胞還有許多問題需要解答，如：①iPS細胞的體外定向分化不明，許多實驗都產生了畸胎瘤或腫瘤；②篩選和鑒定iPS細胞的方法還不夠完善，尤其是在人iPS細胞的鑒定上；③需要兼顧重編程效率和安全性，考慮僅利用mRNA、蛋白或小分子化合物來誘導iPS細胞；④需要找出最合適的供體細胞；⑤重編程機制以及iPS細胞與ES細胞在表觀遺傳修飾和基因表達譜的差異；⑥倫理爭議：iPS細胞的全能性使得產生克隆個體成為可能，這會使iPS細胞重新面臨倫理學上的爭議。雖然iPS細胞現在所面臨的問題仍亟待解決，但隨著研究的深入，iPS細胞有望與胚胎干細胞一樣，被廣泛應用于骨、軟骨、肌肉、神經、上皮、脂肪、血管內皮組織工程，最終投入到臨床上的各類缺損組織修復及美容手術。

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[收稿日期]2013-02-20 [修回日期]2013-04-11

編輯/李陽利