Cd²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺對膨脹腎形蟲的毒性效應

鄒濤 劉先利 黃衛東等

摘要：研究了重金屬Cd2+、Hg2+和Pb2+對膨脹腎形蟲（Colpoda inflata）的毒性效應。在3種重金屬離子作用下，膨脹腎形蟲的生長受到明顯的抑制，對膨脹腎形蟲的毒性從大到小依次為Hg2+、Pb2+、Cd2+。聯合毒性實驗結果表明，3種重金屬離子的不同配比下，聯合作用類型和強度有一定的差異。Cd2+-Pb2+在濃度比1∶1和毒性比1∶1時均為拮抗作用；Pb2+-Hg2+在濃度比1∶1時為協調作用，毒性比1∶1時先表現為拮抗作用后表現為協同作用； Hg2+-Cd2+在濃度比1∶1時為協同作用，毒性比1∶1時為拮抗作用； Cd2+-Pb2+-Hg2+在濃度比1∶1∶1時均為協同作用，毒性比1∶1∶1時由拮抗作用逐漸轉為協同作用。

關鍵詞：重金屬離子；膨脹腎形蟲；急性毒性；聯合毒性

中圖分類號：X171 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）07-1556-05

纖毛蟲是由單細胞構成的完整的生命體，具有生長、呼吸、代謝、排泄等一切生命活動。纖毛蟲與它們所在的環境密切接觸，能對外界環境的變化做出敏捷的反應，且絕大多數纖毛蟲種類為世界性分布，不受季節和地區差異的限制，因此在環境污染監測中具有不可替代的作用[1-3]。在20世紀初，水生纖毛蟲就開始應用于淡水生態系統的監測中，目前水生纖毛蟲作為指示生物已廣泛用在淡水水環境的污染指示與評價中[4-7]，而對土壤纖毛蟲重金屬毒性狀況的研究，尤其是重金屬聯合毒性的研究并不多見。

作為礦業資源枯竭型城市，黃石市正處于城市經濟發展轉型期，其土壤中存在的大量重金屬離子嚴重影響該地區的生態系統，礦區土地的修復與利用已成為經濟發展的瓶頸。選擇廣泛存在于自然環境的膨脹腎形蟲為受試生物，黃石市土壤中常見的金屬Cd、Pb和Hg為毒物，通過單一毒性實驗得出半數抑制濃度（IC50），為更準確地評價重金屬對土壤微生物的毒性提供基礎數據和技術支持。在單一毒性實驗的基礎上，進一步研究3種金屬離子對膨脹腎形蟲的聯合毒性效應，對重金屬污染土壤的再利用、環境質量評價及生態修復提供科學依據有重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1 蟲種及培養

實驗所用的材料為腎形目膨脹腎形蟲（Colpoda inflata），采自湖北理工學院后山，經實驗室用Pringsheim′s 液大量培養繁殖，選取生長狀態良好的個體分離后在室溫下以土壤浸出液為培養液，以米粒繁殖細菌為餌料，建立克隆培養。土壤浸出液的配制是取300 g土壤加入蒸餾水1 000 mL，煮沸10 min，冷卻后用紗布過濾去除沉渣，再用濾紙過濾制得[8]。CdSO4·8H2O、Pb（CH3COO）2·3H2O、HgCl2均為分析純試劑，用蒸餾水配制成200 mg/L母液，實驗時稀釋成所需要的濃度。

1.2 預備實驗

實驗選用6孔細胞培養板，每孔中加入1.5 mL的重金屬培養液，再加入0.5 mL的土壤纖毛蟲母液。以10倍之差估算5個濃度梯度，處理24 h，分別找到Cd2+、Pb2+和Hg2+的100%抑制濃度和無抑制濃度。

1.3 單一金屬離子毒性實驗

根據預備實驗結果設5個濃度組和1個對照組，同時設2個平行組，分別在24、48、72和96 h記錄1 mL培養液中膨脹腎形蟲的個數，重復試驗2次。根據預備實驗結果，各種重金屬離子的正式單一毒性實驗濃度：Cd2+為1.90、3.00、4.80、7.60、12.00 mg/L；Pb2+為2.40、3.80、6.00、9.50、15.00 mg/L；Hg2+為0.20、0.26、0.32、0.40、0.50 mg/L。

1.4 兩種金屬離子聯合毒性實驗

在單一毒性實驗的基礎上，按濃度比1∶1和毒性比1∶1進行Cd2+-Pb2+、Pb2+-Hg2+、Cd2+-Hg2+共存下的聯合毒性實驗。濃度比1∶1時，兩種金屬離子在土壤浸出液中的濃度分別為：Cd2+-Pb2+，1.30、2.00、3.20、5.00、7.90 mg/L；Pb2+-Hg2+，0.016、0.025、0.040、0.060、0.100 mg/L； Hg2+-Cd2+，0.016、0.025、0.040、0.060、0.100 mg/L；毒性比1∶1時，以48 h IC50值為一毒性單位，相應的毒性單位為0.30、0.38、0.49、0.63、0.80。

1.5 3種金屬離子的聯合毒性實驗

按濃度比1∶1∶1和毒性比1∶1∶1進行Cd2+-Pb2+-Hg2+共存下的聯合毒性實驗。濃度比1∶1∶1時，Cd2+-Pb2+-Hg2+在土壤浸出液中濃度分別為0.05、0.08、0.13、0.20、0.32 mg/L；毒性比1∶1∶1時，以48 h IC50 值為一毒性單位，3種溶液的混合按照0.17、0.21、0.26、0.33、0.42倍48 h IC50值進行，相應的毒性單位為0.51、0.63、0.78、0.99、1.26。

1.6 蟲體死亡率的測定

取預實驗獲得的8個梯度（含對照組）的藥物溶液各1 mL，加入10 個蟲體，實驗分2 h 和12 h 兩組，各設3 個平行，結果取其平均值。每隔2 h 觀察1次。

1.7 半數抑制濃度（IC50）的計算方法

采用幾率單位法，根據死亡百分數-幾率單位換算表，將死亡百分數換算成死亡幾率單位，在兩者間成直線關系時，以回歸法求出IC50值[9]。

1.8 聯合毒性的評價方法

經實驗得到單一毒性和聯合毒性的IC50后，采用相加指數法（AI）來評價聯合毒性。具體方法見參考文獻[10]。

2 結果與分析

2.1 單一金屬離子的急性毒性效應

Cd2+、Pb2+、Hg2+對膨脹腎形蟲的單一急性毒性實驗結果見表1。由表1可知，Cd2+、Pb2+和Hg2+對膨脹腎形蟲24 h的IC50分別為11.303、6.840、0.312 mg/L；48 h的IC50分別為 8.951、6.305、0.275 mg/L；72 h的IC50分別為8.714、6.241、0.266 mg/L；96 h的IC50分別為5.196、4.365、0.262 mg/L。

2.2 兩種重金屬離子的聯合毒性作用

兩種重金屬共存時，聯合作用類型見表2-表4。由表2可知，Cd2+-Pb2+在濃度比1∶1和毒性比1∶1時，其AI值均小于零，為拮抗作用，表明Cd2+-Pb2+共存時相互降低了毒性作用。

由表3可知，Pb2+-Hg2+在濃度比1∶1時，其AI值均大于零，為協同作用。毒性比1∶1時， 24 h的AI值小于零，為拮抗作用，48～96 h的AI值均大于零，為協同作用。由此可見，毒性比1∶1時， Pb2+-Hg2+組合的聯合毒性作用是先減弱后增強。

由表4可知，Cd2+-Hg2+在濃度比1∶1時為協同作用，相互增強了毒性作用；毒性比1∶1時為拮抗作用，相互降低了毒性作用。

2.3 3種重金屬離子的聯合毒性作用

3種重金屬共存時，聯合作用類型見表5。Cd2+-Pb2+-Hg2+在濃度比1∶1∶1時為協同作用，表明此時3種離子共存相互增強了毒性。毒性比1∶1∶1時，24和48 h的AI值小于零，為拮抗作用，72和96 h的AI值均大于零，為協同作用，表現出毒性作用先減弱后增強。

3 討論

3.1 單一金屬離子對膨脹腎形蟲的急性毒性效應

在不同濃度的重金屬作用下，膨脹腎形蟲的生長受到明顯抑制。比較3種重金屬離子在相同暴露時間下的IC50值，可得出3種重金屬離子對膨脹腎形蟲的毒性從大到小依次為Hg2+、Pb2+、Cd2+。李娜等[11]以鹵蟲（Artemia salina）無節幼蟲為試驗材料，張青田等[12]以俄羅斯鹵蟲（Artemia parthenogenetica），Rehman等[13]以Euplotes mutabilis為試驗材料研究了Hg2+、Pb2+、Cd2+等毒性作用，其毒性由強到弱的順序為Hg2+、Pb2+、Cd2+，陳娜等[14]以水螅（Hydra sp.）為試驗材料研究重金屬離子的毒性作用，結果表明其毒性大小順序為Hg2+、Cd2+、Pb2+，而Al-Rasheid等[15]以Euplotes mutabilis為試驗材料研究重金屬離子的毒性作用，結果表明其毒性大小順序為Pb2+、Cd2+、Hg2+，說明金屬離子對生物體的毒性大小因物種而異。但總體上Hg2+的毒性比其他離子要大。3種重金屬離子IC50值隨作用時間的延長而變小，具有明顯的時間-效應關系，這表明隨著作用時間延長，膨脹腎形蟲對重金屬離子的耐受性降低，這可能與重金屬離子在生物體內的積累有關。

3.2 金屬離子對膨脹腎形蟲的的聯合毒性效應

污染物的聯合毒性作用是一個復雜的問題，對于聯合作用的機理尚不明了，特別是對3種以上金屬離子的聯合毒性研究并不多見。Cd是生物體非必需元素，它使某些活性傳遞機制受阻，酶失活以及內分泌系統受影響，并引起DNA單鏈斷裂，損害DNA修復系統，從而導致細胞凋亡[9，16]。Pb對生物體也有較強的毒性，能降低SOD的活性，從而導致氧自由基蓄積，引起生物膜脂質過氧化作用而造成機體損害[9，17]。低濃度的Pb2+對酶有激活作用，高濃度則有抑制作用，而且是慢性毒性作用[18]。Hg 對于生物體一般都是劇毒的，Hg 的毒性很可能起因于它對巰基具有極大的親和作用，從而導致許多蛋白質和酶的失活[16]。已有研究表明細菌Enterobacter aerogenes存在利用汞離子還原酶解毒的機制[19]，在纖毛蟲體內也可能存在類似對Hg 進行解毒的機制。該機制在低濃度Hg作用下即可啟動，只有當外界Hg 濃度超過其解毒能力時方產生毒害作用。

試驗結果表明濃度比1∶1時，Cd2+或Pb2+對Hg2+的毒性具有協同作用，可能是低濃度的Cd2+或Pb2+與Hg2+共存于生物體時，使其細胞膜的通透性加大，從而毒性增強。毒性比1∶1時，Cd2+對Pb2+或Hg2+的毒性具有拮抗作用，這可能是由于Cd2+與Pb2+或Hg2+對進入細胞的生物活性位點競爭的結果。由于金屬進入細胞的活性位點有限，當Cd2+濃度遠大于Pb2+或Hg2+濃度時，這些進入細胞的活性位點大部分被Cd2+所占據，使毒性較大的Pb2+或Hg2+無法進入細胞。濃度比1∶1時Cd2+或Pb2+對Hg2+的毒性作用與毒性比1∶1時的作用結果不同，說明聯合作用效應還與混合物的濃度及各組分的配比有關。實驗結果與陳娜等[14]、隋國斌等[20]、王銀秋等[21]、高曉莉等[22]的研究結果有一定的差異，可能的原因是聯合作用效應不僅與污染物組成有關，也與測試生物的種類有關。

毒性比1∶1時，Pb2+-Hg2+組合24 h為拮抗作用，48～96 h轉為協同作用；Cd2+-Pb2+-Hg2+組合24～48 h為拮抗作用，72～96 h為協同作用，表明污染物對膨脹腎形蟲的聯合毒性隨暴露時間的不同而不同。修瑞琴等[23]在研究氟和硒對斑馬魚的聯合毒性，陳碧娟等[24]在研究乙醛和乙二醇對草魚幼魚聯合毒性時也發現類似的現象。至于這種先拮抗、后協同方式的作用機理尚不明確，需做進一步的研究。

不同的生物種類對同一復合污染條件下的各個污染物以及污染物之間的交互作用有不同的反應模式[25]。因此，當幾種金屬離子共存于環境中時會產生復雜的聯合毒性效應，僅用單一毒物的含量去判斷污染的毒性危害是不切實際的，生態環境的污染評價在測定單一毒物含量的同時，還應從聯合毒性的角度對土壤污染做出綜合評價。

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