宰后牦牛肉成熟過程中鈣激活酶與嫩度指標的相關性分析

師希雄 余群力 黨欣

摘 要：以10頭甘南牦牛為研究對象，對宰后8d 成熟期間肌原纖維小片化指數、剪切力、肌纖維直徑、μ-鈣蛋白酶（μ-calpain）、m-鈣蛋白酶（m-calpain）、鈣蛋白酶抑素（calpastatin）的活力進行了測定，同時研究了3種酶活力與肌原纖維小片化指數、剪切力、肌纖維直徑3個嫩度指標之間的相關性。結果表明：μ-calpain、m-calpain、calpastatin 3種酶與剪切力值及肌纖維直徑均呈正相關；3種酶與肌原纖維小片化指數呈負相關，其中μ-calpain與calpastatin呈顯著負相關（P<0.05）。因此，鈣激活酶活力的變化可能導致了肌原纖維小片化指數的增加，肌原纖維的弱化和肉的嫩化，μ-calpain可能是牦牛肉嫩化的主要貢獻者。

關鍵詞：牦牛肉；成熟；鈣激活酶；嫩度

中圖分類號：TS251.1 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2013）06-0001-04

肉的嫩度是所有肉品質中最重要的指標之一，它將決定肉是否被重復購買[1-2]。成熟是改善肉嫩度的有效方法之一。肉的最終嫩度取決于由內源蛋白酶引起的肌原纖維結構改變和弱化的程度，這些內源蛋白酶包括鈣激活酶、組織蛋白酶、細胞凋亡酶、蛋白酶體等[3]。目前，普遍認為，鈣激活酶在肉的嫩化中起著重要的作用[4]。骨骼肌中的鈣蛋白酶包括鈣蛋白酶1（μ-calpain）、鈣蛋白酶2（m-calpain）、鈣蛋白酶3（p94）以及鈣激活酶的內源性的專一抑制蛋白（calpastatin）[5]。

李誠等[6]研究表明，杜長大三元雜交豬的背最長肌（longissimus dorsi，LDM）、腰大?。╬soas major，PM）兩種不同部位豬肉在宰后0～4℃冷卻成熟過程中鈣蛋白酶粗酶液活性、肌原纖維小片化指數（myofibril fragmentation index，MFI）和剪切力之間呈現較高的相關性。田甲春等[7]研究發現，青海牦牛肉成熟過程中MFI 和鈣激活酶活性相關性極顯著，與組織蛋白酶L活性相關性顯著，鈣激活酶活性與組織蛋白酶L活性呈顯著負相關。郭兆斌等[8]研究了甘南牦牛肉成熟過程中食用品質、鈣激活酶粗酶活性、肌原纖維超微結構的變化規律。關于宰后牦牛肉成熟過程中μ-calpain、m-calpain及calpastatin的變化報道極少，特別是甘南牦牛肉成熟過程中μ-calpain，m-calpain及calpastatin的變化及其與嫩度指標的相關性未見報道。本實驗旨在研究甘南牦牛肉宰后成熟過程中μ-calpain、m-calpain及calpastatin的變化及其與嫩度指標的相關性，以便為構建牦牛肉嫩度的預測模型提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

隨機選取甘南藏族自治州夏河縣，自然放牧條件下，發育正常健康無病、年齡3歲左右的黑牦牛12頭，進行屠宰，宰后牦牛的背最長肌立即被移除，分割成平均質量為50g的樣品，帶回實驗室，在0～4℃的條件下成熟0、1、3、5、7、8d，不同成熟時間點收集的樣品，一部分在-80℃的條件下冷凍用于測定鈣激活酶的活性，另一部分測定剪切力、肌原纖維小片化指數及肌纖維直徑。酪蛋白、Tris、MCE、亮肽素、PMSF、卵類黏蛋白抑制劑、EDTA均購自Sigma公司。

1.2 儀器與設備

C-LM型數顯式肌肉嫩度儀 北京陽光億事達貿易有限公司；PPS-2蛋白純化系統 上海金達生化儀器公司；XSP-8CA顯微鏡 上海光學儀器一廠。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維小片化指數測定

參考Kriese等[9]的方法進行測定。

1.3.2 剪切力測定

沿著肌纖維方向取厚度3cm的肉樣，在80℃水浴鍋中恒溫加熱至肉樣中心溫度達75℃，取出冷卻至室溫后，用直徑1.27cm的取樣器沿肌纖維方向鉆取3個肉柱測定樣，用嫩度儀測定剪切力值，剪切力值以N表示。每個肉樣平行測定3次，取平均值。

1.3.3 肌纖維直徑測定

參考李鵬等[10]的方法，取背最長肌的中央部位 3cm×2cm×1cm肉塊3塊，浸泡到1：10（V/V）甲醛溶液中，然后在10×40倍顯微鏡下隨機計數200根肌纖維直徑，求其平均值。

1.3.4 鈣激活酶活性的測定

1.3.4.1 酶的分離與純化

參考Delgado等[11]的方法并稍做改動。取宰后不同時間點的牦牛肉樣品，準確記錄其質量，絞碎后于4℃勻漿，加入150mL抽提液（pH8.3、100mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，10mmol/L β-巰基乙醇（MCE），100mg/L 卵類黏蛋白抑制劑，2mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF），5mg/L亮抑酶肽），以勻漿3min，間隔3min模式運行，共5次。然后離心（4℃，18000×g，120min），去沉淀，取上清，并以0.45μm針式濾膜過濾。對過濾后的上清取（NH4）2SO4分級沉淀部分，用25mL勻漿緩沖液溶解沉淀部分并用25倍體積的透析液（4℃，40mmol/L Tris-HCl，pH7.35；5mmol/L EDTA；10mmol/L MCE）進行透析。透析后的溶液離心（4℃，18000×g，60min）取上清，并以0.45μm針式濾膜過濾后上柱。

DEAE-Sephacel離子交換柱（1.6cm×20cm），首先用平衡緩沖液（TEMA）（4℃，50mmol/L Tris-HCl，pH7.5；0.5mmol/L EDTA；10mmol/L MCE）進行平衡，用TEMA將雜蛋白洗脫至基線，目標蛋白用0→400mmol/L NaCl的TEMA溶液進行線性梯度洗脫，流速0.5mL/min，每管3mL被收集，calpastatin在20～110mmol/L NaCl濃度的范圍被洗脫下來，μ-calpain在110～165mmol/L NaCl濃度的范圍被洗脫下來，m-calpain在220～330mmol/L NaCl濃度的范圍被洗脫下來。

1.3.4.2 鈣激活酶活性測定

參考Morton等[12]的方法。

1.4 數據處理與統計分析

用SPSS16.0對數據進行方差分析，并用Duncan 法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 宰后牦牛肉成熟過程中鈣激活酶活性的變化

由表1可知，在宰后牦牛肉成熟過程中，μ-calpain的活性在宰后5d之內顯著降低，5d后，μ-calpain活性變化不顯著，m-calpain的活性在宰后1d之內稍有降低，之后，變化不顯著，calpastatin的活性在宰后3d內差異不顯著，3d之后活性不斷降低。3種酶在宰后成熟過程中的變化趨勢與Delgado等[11]的報道基本一致。

μ-calpain與m-calpain需要足夠的鈣離子才能激活，激活后酶將遭受自溶，μ-calpain的自溶導致了酶的不穩定，最終導致了活力的喪失[13]。calpastatin活力的降低是由于鈣激活酶抑制蛋白多肽的降解造成的[14]。

2.2 宰后牦牛肉成熟過程中嫩度指標的變化

2.2.1 剪切力值的變化

肉的嫩度又稱為肉的柔軟性，指肉在食用時口感的老嫩，反映了肉的質地。它在本質上取決于肌纖維直徑、肌纖維密度、肌纖維類型、肌纖維完整性、肌內脂肪含量、結締組織含量及類型等[15]。肉嫩度評定最常用的方法是用嫩度儀測定剪切力，剪切力值越低，肌肉越嫩。圖1反映宰后牦牛肉在成熟8d的過程中剪切力值的變化，在宰后0～3d內，剪切力值顯著升高，在3～5d內，剪切力值顯著降低，7d后變化不顯著。最初剪切力值的逐漸增加是肌肉僵直的典型特征，隨后剪切力值的逐漸變小是逐漸成熟的過程[16]。

2.2.2 肌原纖維小片化指數

肌原纖維小片化指數是反映肌原纖維蛋白降解程度的有用標志，MFI值越大表明降解的越多，肉會變得越嫩[17]。從圖2可以看出，肌原纖維小片化指數呈現顯著增加的趨勢，在前3d增加的速度較快，3d后增加的速度有所降低，成熟5d后不再發生顯著變化。牦牛肉成熟過程中肌原纖維小片化指數的變化趨勢與Watanabe等[18]的研究結果相一致。

2.2.3 肌纖維直徑

圖3反映了宰后牦牛肉成熟過程中，肌纖維直徑的變化，在宰后0d時，肌纖維直徑為48.23μm，隨著成熟時間的延長，不斷降低，前3d變化不顯著，后5d明顯降低，但是第7天與第8天差異不顯著。

肌纖維直徑是決定肉嫩度的重要因素，肌纖維越細，肌纖維密度越大，系水力越強，表現為肉質細嫩，在成熟過程中，由于肌纖維與肌內膜發生分離及汁液的流失，導致肌纖維直徑下降[19]。

2.3 鈣激活酶與嫩度指標的相關性

表2反映了宰后牦牛肉成熟過程中，μ-calpain、m-calpain、calpastatin 3種鈣激活酶與剪切力、肌纖維直徑、MFI 3個嫩度指標之間的相關性。從表2可以看出，μ-calpain、m-calpain、calpastatin與剪切力值、MFI均呈正相關性，但是，相關性不顯著；3種酶均與肌原纖維小片化指數呈負相關，其中，μ-calpain與calpastatin呈顯著負相關（P<0.05）。由此可以推斷，鈣激活酶活力的變化可能導致了肌原纖維小片化指數的增加，肌原纖維的弱化和肉的嫩化，μ-calpain可能是牦牛肉嫩化的主要貢獻者。

3 結 論

3.1 宰后牦牛肉成熟過程中，μ-calpain與calpastatin的活力顯著降低，m-calpain活力稍有降低；剪切力值先增大后減小，肌原纖維直徑顯著降低，MFI顯著增加。

3.2 μ-calpain、m-calpain、calpastatin 3種酶與剪切力值及肌纖維直徑均呈正相關，與肌原纖維小片化指數呈負相關，其中，μ-calpain與calpastatin呈顯著負相關。因此，鈣激活酶活力的變化可能導致了肌原纖維小片化指數的增加，肌原纖維的弱化和肉的嫩化，μ-calpain可能是牦牛肉嫩化的主要貢獻者。

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