辛伐他汀對人牙髓干細胞成骨活性的影響

運慧媛　袁夢桐　劉明月　王鈺瑩　繆宏穎

[摘要]目的：研究辛伐他汀對人牙髓干細胞成骨活性的影響。方法：將體外分離培養(yǎng)的人牙髓干細胞分別接種于含有不同濃度辛伐他汀的礦化培養(yǎng)液中誘導(dǎo)培養(yǎng)，測定堿性磷酸酶活性及骨唾液酸蛋白基因的表達情況。結(jié)果：與對照組比較，適宜濃度辛伐他?。?×10^-6mol/L、1×10^-7mol/L、1×10^-8mol/L）促進人牙髓干細胞的成骨活性作用更為明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），當(dāng)辛伐他汀濃度為1×10^-7mol/L時，促進作用最顯著。結(jié)論：適宜濃度的辛伐他汀可以有效促進人牙髓干細胞的成骨活性。

[關(guān)鍵詞]牙髓干細胞；辛伐他??；成骨活性

[中圖分類號]Q813.1 R782.1 [文獻標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）06-0644-04

辛伐他汀為一種無活性的內(nèi)酯類結(jié)構(gòu)藥物，口服后在肝臟中吸收，主要水解為相應(yīng)的β-羥酸，此結(jié)構(gòu)是催化膽固醇合成的早期限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme A reductase，HMG-CoA）還原酶的抑制劑。辛伐他汀臨床常用于控制血液中膽固醇的含量以及預(yù)防心血管疾病的發(fā)生。與相同劑量的洛伐他?。╨ovastatin）、普伐他?。╬ravastatin）和氟伐他汀（fluvastatin）等其他HMG-CoA還原酶抑制劑相比，辛伐他汀可以更有效地降低血清中的總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-cholesterol）的含量，臨床療效更為顯著。實驗研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀亦具有促細胞成骨分化的功能，為辛伐他汀的臨床應(yīng)用開辟了新的領(lǐng)域。Mundy等通過熒光素酶標(biāo)記基因轉(zhuǎn)染等多種實驗途徑，首次驗證了辛伐他汀的體內(nèi)及體外促成骨活性。2009年，Okayama等實驗證明辛伐他汀能激活BMP-2的啟動子，誘導(dǎo)BMP-2 mRNA和蛋白的表達，提示其具有刺激骨形成的作用。人牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）可向成骨細胞、神經(jīng)細胞、脂肪細胞、肌細胞等多種細胞分化，擁有多向分化的潛能，它可以作為一種組織工程的種子細胞。組織工程修復(fù)牙體及頜骨缺損一直以來是口腔修復(fù)的目標(biāo)，人牙髓干細胞作為一種組織來源更為接近的種子細胞，口腔科組織工程應(yīng)用更具優(yōu)勢。本實驗旨在證明人牙髓干細胞作為種子細胞的可行性，為牙體及頜骨缺損的組織工程修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料：胎牛血清（Hyclone，美國）；DMEM F/12（Gibco，美國）培養(yǎng)基；I型膠原酶（Gibco，美國）；胰酶（碧云天生物技術(shù)研究所，上海）；青鏈霉素（碧云天生物技術(shù)研究所，上海）；PBS緩沖溶液；抗壞血酸（sigma，美國）；β-甘油磷酸鈉（sigma，美國）；L-谷氨酰胺（sigma，美國）；茜素紅（sigma，美國）；堿性磷酸酶試劑盒（南京建成生物工程研究所，南京）；辛伐他汀（sigma，美國）；Triton X-100（碧云天生物技術(shù)研究所，上海）。TRNzol總RNA提取試劑（天根生化科技有限公司，北京）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Bioneer，韓國）；PCR試劑盒（創(chuàng)奇，北京）

1.2 方法

1.2.1 DPSCs分離培養(yǎng)及傳代：選擇哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔外科門診采集的因正畸拔除的正常前磨牙或阻生的正常第三磨牙（患者14～25歲），所有成年患者及未成年患者家屬均知情同意。依據(jù)Gronthos DPSCs原代細胞培養(yǎng)法，劈開實驗牙，用鑷子取出牙髓，含雙抗PBS充分沖洗，置于體積分數(shù)為0.3%的I型膠原酶和0.4%的分散酶（1：1）37℃橫濕振蕩器內(nèi)消化1h，200目尼龍篩過濾懸液至10ml離心管中，1000rpm離心5min，棄上清，加入含20%FBS培養(yǎng)基，吹打混勻，血球計數(shù)板計數(shù)以1×10⁸個/L細胞接種至50ml培養(yǎng)瓶，37℃，5%CO₂恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換液兩次，細胞融合達80%后，0.25%胰蛋白酶消化，1：2比例傳代。

1.2.2 DPSCs鑒定

1.2.2.1 細胞形態(tài)學(xué)鑒定：倒置相差顯微鏡觀察細胞的生長情況和形態(tài)特征。

1.2.2.2 礦化結(jié)節(jié)鑒定：將第三代人DPSCs以1×10⁵個/孔接種于六孔板中，12h后，各孔換為礦化培養(yǎng)液（DMEM F/12培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、100μmol/L抗壞血酸，10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，2mmol/L L-谷氨酰）繼續(xù)培養(yǎng)14天后進行茜素紅染色，培養(yǎng)皿PBS緩沖液沖洗3遍，95%無水乙醇固定15min，蒸餾水沖洗3次，0.1%茜素紅-Tris—HCI（pH=8.3）37℃孵育30min，蒸餾水輕輕沖洗，干燥，照相。

1.2.3 堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性測定：將第三代人DPSCs以5×10³個/孔接種在九十六孔板中，12h后，各孔換為礦化培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)分A、B、C、D四組，各組辛伐他汀濃度為A組：1×10^-6mol/L；B組：1×10^-7mol/L：C組：1×10^-8mol/L；D組：0 mol/L。每組各10孔，繼續(xù)培養(yǎng)3天，去除培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，0.01mol/L PBS沖洗細胞3次，加入50μl 0.1%Triton X-100，4℃冰箱過夜，光鏡下觀察已無明顯細胞結(jié)構(gòu)，反復(fù)吹打后每個樣本加入ALP緩沖液和基質(zhì)液各50μl，充分混勻，37℃水浴15min，加入顯色劑150μl，在酶標(biāo)儀上選擇520nm波長檢測各孔吸光度（A）值，觀察各組細胞ALP活性。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測骨唾液酸蛋白基因表達：將第三代人DPSCs以1×105個/孔接種于六孔板中，12h后，各孔換為礦化培養(yǎng)液，細胞培養(yǎng)分A、B、C、D四組，各組辛伐他汀濃度為A組：1×10^-6mol/L；B組：1×10^-7mol/L：C組：1×10^-8mol/L；D組：0mol/L。每組樣本量為3，繼續(xù)培養(yǎng)7天后進行RT-PCR實驗。依據(jù)操作手冊使用Trizol試劑裂解細胞，提取總mRNA。參照RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書將總mRNA依次按70℃5min、50℃ 1h、95℃5min逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)條件為：94℃2min預(yù)變性后，94℃ 30s、48.2℃30s、72℃ 30s，35個循環(huán)，72℃ 2min延伸，4℃保存。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)分析。以電泳條帶的強度×面積求得基因表達量，將基因表達量除以管家基因表達量求得基因陽性表達水平。RT-PCR引物序列（見表1）。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析：使用SPSS 15.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量資料采用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式描述。

對實驗組與對照組檢測結(jié)果進行t檢驗和方差分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 DPSCs光學(xué)顯微鏡下細胞形態(tài)學(xué)變化：DPSCs原代培養(yǎng)24h內(nèi)細胞貼壁緩慢，可見細胞為梭形，形態(tài)較小，未完全伸展，且有少量懸浮未貼壁細胞。48h，細胞梭形，貼壁較多，少量細胞呈克隆團狀生長（見圖1）。7天后可見DPSCs大量擴增，呈伸展長梭形，克隆團狀聚集生長，細胞融合率可達80%（見圖2）。

2.2 礦化結(jié)節(jié)鑒定：DPSCs 14天培養(yǎng)后，可見部分細胞發(fā)生成骨細胞樣多角形以及錐體形態(tài)改變。DPSCs在礦化誘導(dǎo)后逐漸產(chǎn)生白色點狀晶體。經(jīng)茜素紅染色后光學(xué)顯微鏡下可見橘紅色礦化結(jié)節(jié)，呈團狀不規(guī)則形態(tài)（見圖3）。

2.3 辛伐他汀對DPSCs堿性磷酸酶活性的影響：在礦化誘導(dǎo)條件下，辛伐他汀對人牙髓干細胞ALP活性有促進作用，1×10^-6mol/L、1×10^-7mol/L、1×10^-8mol/L組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中1×10^-7mol/L組對ALP活性的影響最顯著（見表2）。

2.4 辛伐他汀對DPSCs BSP表達的影響：與對照組比較，各組BSP表達均較高。其中，辛伐他汀濃度為1×10^-7mol/L時，BSP表達量最高（見表3）。

3 討論

多項體內(nèi)及體外的實驗研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀具有明顯的促進骨形成的作用。2001年，Meada等發(fā)表文章，研究辛伐他汀作用下，非轉(zhuǎn)化成骨樣細胞MC3T3-E1和鼠骨髓細胞的生長情況，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀提高成骨細胞堿性磷酸酶活性并促進礦化結(jié)節(jié)形成，此效應(yīng)呈時間、劑量依賴性。胡飛等研究辛伐他汀對人牙周膜細胞成骨活性的影響，證明適宜濃度辛伐他汀提高了人牙周膜細胞ALP活性和骨橋蛋白的表達，有效促進了人牙周膜細胞的成骨活性。Chan等統(tǒng)計分析表明，服用他汀類藥物可增加股骨頸骨密度，長期服用降低老年婦女發(fā)生非病理性骨折的危險性。張曉艷等利用含有β-甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C的條件培養(yǎng)液，成功誘導(dǎo)人前磨牙牙髓干細胞向成骨細胞樣細胞的分化，充分說明人牙髓干細胞的骨向分化潛能，為人牙髓干細胞的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

ALP是一種分泌型蛋白，它的表達是成骨細胞分化的主要特征之一，是基質(zhì)成熟的早期標(biāo)志物。其主要作用是水解胞漿中的有機磷酸釋放出無機磷，促使基質(zhì)礦化。測定細胞內(nèi)ALP活性變化作為一種常用的手段用于細胞成骨分化程度和細胞礦化能力的檢測。當(dāng)成骨細胞進入礦化期，細胞內(nèi)堿性磷酸酶活性下降，而此時與細胞外基質(zhì)中羥基磷灰石沉積相關(guān)的基因表達達到高峰，如骨橋蛋白、骨鈣素、骨唾液酸蛋白基因。骨唾液酸蛋白由成骨細胞、破骨細胞以及其他一些骨相關(guān)細胞合成和分泌，其表達局限于礦化組織中。

本實驗通過ALP試劑盒、RT—PCR法觀察辛伐他汀作用后，人DPSCs礦化能力的改變。結(jié)果表明辛伐他汀濃度在1×10^-8mol/L～1×10^-6mol/L范圍內(nèi)，與對照組比較，ALP活性及BSP基因的表達量均提高，當(dāng)辛伐他汀濃度為1×10^-7mol/L時，促進作用最明顯，證實辛伐他汀誘導(dǎo)人DPSCs是一種可行、有效的促進成骨活性的方法，與以往的實驗結(jié)論相同。但辛伐他汀的有效作用濃度各實驗研究結(jié)果不盡相同，可能與細胞種類、培養(yǎng)方法及培養(yǎng)環(huán)境相關(guān)，還有待進一步的研究。