普伐他汀對培養人內皮祖細胞藥理作用的影響

肖剛峰　張懷勤

[摘要] 目的 觀察普伐他汀對培養人內皮祖細胞（EPC）數量、增殖、遷移、黏附及一氧化氮（NO）合成能力的影響。 方法 采用密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞，貼壁篩選法培養內皮祖細胞，培養7 d后收集細胞并分別加入普伐他汀10 μmol/L及100 μmol/L，干預48 h， 免疫組化、熒光顯微鏡和流式細胞儀鑒定內皮祖細胞， 分別觀察內皮祖細胞的數量、增殖遷移黏附能力、細胞內皮型一氧化氮合酶（eNOS）、mRNA 的表達以及培養液中NO的水平。 結果 普伐他汀組促進外周血內皮祖細胞擴增，并顯著改善外周血內皮祖細胞的黏附、遷移、增殖以及eNOS mRNA 表達和NO 合成的能力。 結論 他汀類藥物可增加培養人內皮祖細胞數量并改善其功能。

[關鍵詞] 普伐他汀；內皮祖細胞；細胞培養

[中圖分類號] R965 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）06-0016-03

他汀類藥物是目前臨床上最常見的血脂調節藥物，廣泛應用于動脈粥樣硬化、高脂血癥等疾病的防治，其作用機制為抑制膽固醇合成途徑的HMG-CoA還原酶，從而降低低密度脂蛋白膽固醇水平。近年來研究發現，其除降脂作用外還存在非降脂作用，比如能改善血管內皮功能，上調成熟血管內皮細胞eNOS的活性和NO的合成[1]。內皮祖細胞（EPC）作為血管內皮的前體細胞，具有血管內皮細胞相似的特性，不僅參與新生血管形成（angiogenesis）以及出生后血管生成（vasculogenesis），而且參與損傷內皮的修復，在血管內皮功能中扮演著重要的角色。為進一步研究他汀類藥物改善內皮功能的機制，本實驗觀察了普伐他汀對體外培養的內皮祖細胞數量和功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗血樣取自成年健康男性志愿者外周血約80 mL。普伐他汀由浙江大學醫學院心血管病研究所贈予。MTT試劑、培養基M199（Sigma公司），FITC-抗鈣黏著蛋白單克隆抗體（VE-Cadherin，Bender system TM 公司），PE-抗CD34單克隆抗體（CALTAG LABORATORIES），FITC-抗CD133單克隆抗體（R&D公司）， PE-抗VEGFR-2單克隆抗體，Dil標記的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-ac-LDL，Molecular Probe公司），Ⅷ因子相關抗原免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），改良的Boyden 小室（江蘇海門麒麟醫用儀器廠），RT-PCR試劑盒（寶生物工程大連有限公司），內皮型一氧化氮合成酶 PCR引物（上海生物工程有限公司），GAPDH引物（Clontech公司），NO測試盒（南京建成生物工程研究所）。其余為市售試劑。

1.2 方法

1.2.1 EPC的培養和鑒定 取成年健康男性新鮮外周血80 mL，加等體積Hanks液稀釋并混勻后采用離心法獲取單個核細胞，將細胞接種于包被纖維連接蛋白的24孔培養板中，M199培養基（包含有VEGF 10 ng/mL、20%胎牛血清、鏈霉素100 IU/mL及青霉素100 IU/mL）中培養，3 d后洗去未貼壁的懸浮細胞，更換相同培養液繼續培養。

0.25%胰酶消化培養第6天貼壁細胞，制成單個細胞懸液，應用流式細胞儀分別檢測細胞VE-Cadherin、VEGFR-2、CD34及CD133表達。培養第6天將細胞與終濃度2.4 μg/mL 的Dil標記的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-ac-LDL）避光共孵育4 h，洗去培養液后熒光顯微鏡下觀察細胞熒光來檢測細胞對Dil-ac-LDL的攝取。細胞Ⅷ因子相關抗原的表達采用免疫組化法測定。根據細胞形態、流式細胞術、熒光細胞化學染色、免疫組化等結果，綜合判定培養細胞是否為人內皮祖細胞。

1.2.2 分組 將培養第7天的各孔細胞消化下來并接種到24孔培養板上，接種密度為1×104/cm2。隨機分為3組：① 常規培養液的對照組，②10 μmol/L普伐他汀條件培養液的干預組，③100 μmol/L普伐他汀條件培養液的干預組。每組6孔，培養48 h后，進行數量和功能的測定。

1.2.3計數EPC數量 在顯微鏡下對各孔具有典型內皮細胞形態的貼壁紡錘形細胞進行計數（×200各孔取上下左右中5個視野）。

1.2.4 檢測EPC黏附能力 消化各組貼壁細胞，重懸浮于1 mL培養液中，并計數，然后以同等數目接種在培養板上，培養30 min，洗去未貼壁細胞，計數貼壁細胞數。

1.2.5 檢測EPC增殖能力 消化各組貼壁細胞，重懸浮于1 mL培養液中，再將相同數目細胞接種到96孔培養板，每孔加10 μL MTT，培養4 h后，吸棄上清液，再每孔加入150 μL二甲基亞砜，于微量振蕩器充分振蕩10 min，置酶標儀上于490 nm處測吸光度（OD值）。

1.2.6 檢測EPC遷移能力 消化各組細胞，重懸浮并計數。先將培養液100 μL加入改良Boyden小室的下室，再將2×104細胞懸浮在培養液150 μL中，注入上室，培養24 h，刮去濾膜上未移動的細胞，用甲醇固定，蘇木素染色，隨機選擇4個顯微鏡視野（×200），計數遷移的細胞。

1.2.7 檢測EPC eNOS表達和NO濃度 按照RT-PCR試劑盒要求操作提取各組細胞RNA并進行RT-PCR（n=6），按照一氧化氮測試盒要求測試各組各孔培養液中NO的濃度（n=6）。

1.3 統計學分析

所有數據以x±s表示，輸入SPSS13.0軟件包，采用t檢驗比較各組均數，P < 0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 EPC的鑒定

培養3 d后即可見到大量放射狀的細胞集落以及圓形或不規則形狀的貼壁細胞（圖1A）。培養3～7 d，絕大多數細胞逐漸分化為梭形細胞，出現條索樣或軌道樣結構。Dil-ac-LDL避光共孵育的細胞熒光顯微鏡下激發紅色熒光（圖1B），提示貼壁細胞吞噬Dil-ac-LDL。培養細胞Ⅷ因子相關抗原免疫組化呈陽性，胞漿顯棕色（圖1C）。培養第6天的細胞經流式細胞儀分析：表達VE-Cadherin、VEGFR-2、CD34、CD133的細胞分別為（55.28±3.66）%、（40.24±3.67）%、（52.21±3.52）%及（19.55±3.48）%。綜合細胞形態、流式細胞術、熒光細胞化學染色、免疫組化結果證實培養細胞為內皮祖細胞。

2.2普伐他汀對EPC數量的影響

與對照組相比，普伐他汀干預組的貼壁細胞數更多，提示普伐他汀能增加培養內皮祖細胞的數量（t=7.5813、3.9338，P <0.01），見表1 ；兩不同濃度普伐他汀干預組之間差異無統計學意義（t=1.6919，P > 0.05 ）。見表1。

2.3 普伐他汀對EPC黏附能力的影響

與對照組相比，普伐他汀干預組的貼壁細胞更多，提示普伐他汀能提高培養內皮祖細胞黏附能力（t=2.9773、6.4577，均P < 0.01）。干預組中以100 μmol/L組提高培養內皮祖細胞黏附能力較顯著（t=5.0081，P < 0.01）。見表1。

2.4 普伐他汀對EPC增殖能力的影響

與對照組相比，兩不同濃度普伐他汀干預組的OD值更高，提示普伐他汀能提高培養內皮祖細胞增殖的能力（t=6.4111、8.7093，均P < 0.01）。干預組中以100 μmol/L組提高培養內皮祖細胞增殖能力較顯著（t=3.3714，P < 0.01）。見表1。

2.5 普伐他汀對EPC遷移能力的影響

與對照組相比，兩不同濃度普伐他汀干預組的遷移細胞數更多，提示普伐他汀能提高培養內皮祖細胞遷移的能力（t=8.2957、3.5791，均P < 0.05）干預組中以10 μmol/L組提高培養內皮祖細胞遷移能力較顯著（t=3.4946，P < 0.05）。見表1。

2.6普伐他汀對EPC eNOS表達的影響

見圖2，RT-PCR結果經半定量分析，100 μmol/L普伐他汀干預組提高了培養內皮祖細胞 eNOS表達[（0.91±0.45）% vs （0.50±0.31）%，t=1.8379，P < 0.05 ]；10 μmol/L普伐他汀條件培養液和100 μmol/L普伐他汀條件培養液干預組之間無明顯差異[（0.85±0.39） vs （0.91±0.45）%，t=0.2468，P > 0.05）]。

2.7普伐他汀對EPC NO合成的影響

與對照組相比，普伐他汀干預組的培養液NO濃度較高，提示普伐他汀能增加培養內皮祖細胞 NO合成（60.76±7.26、71.25±11.26 vs 47.70±6.13，t=3.3668、4.4995，P < 0.05）；干預組中100 μmol/L普伐他汀條件培養液組NO濃度更高（t=1.9179，P < 0.05）。

3 討論

血管內皮功能障礙被認為是動脈粥樣硬化形成的始動因子之一。其主要特征表現為內皮細胞凋亡增加以及內皮源性的NO 合成、釋放和活性受損等。內皮祖細胞是一群能定向分化為成熟血管內皮細胞的干/祖細胞，具有血管內皮細胞相似特性但增殖能力更強。近年來研究發現，內皮祖細胞在血管內皮損傷修復中扮演著重要角色，內皮損傷時除了相鄰成熟內皮細胞延展修復外，還有相當一部分是通過外周血中循環的內皮祖細胞歸巢到損傷部位分化為成熟內皮細胞來完成的[2，3]。更有研究發現冠心病等缺血性疾病患者血中的循環內皮祖細胞數量下降和功能受損且易老化[4]。因此內皮祖細胞有可能成為治療冠心病等缺血性疾病的一個新靶點。發現一些能改善內皮祖細胞數量功能的藥物，將是防治冠心病等缺血性疾病的新途徑。

近年來研究發現，他汀類藥物不僅有降脂作用還存在非降脂作用，如改善血管內皮功能、調節免疫以及改善胰島素抵抗等。在改善血管內皮功能方面，他汀類藥物不僅能上調血管內皮細胞eNOS的活性和NO的合成，而且有研究提示他汀類藥物能增加缺血性疾病患者循環內皮祖細胞水平[5]，并能促進其動員增殖、凋亡減少、活性增加[6-8]。經多年研究，他汀類藥物對成熟血管內皮細胞功能影響已經較明確，如能減少凋亡、增加遷移黏附以及eNOS的活性、NO合成和分泌等等。但作為血管內皮的前體細胞——內皮祖細胞由于發現較晚，與他汀類藥物的作用關系研究仍較少。因其擁有與成熟血管內皮細胞相似的特性，比如能表達eNOS并合成分泌NO[9]。有研究發現他汀類藥物增加循環內皮祖細胞數量的機制可能與NO的合成分泌有關[10]。故我們猜測他汀類藥物對內皮祖細胞功能有類似影響。在本實驗中，筆者觀察到加入普伐他汀共培養的內皮祖細胞數量增加，增殖、遷移、黏附能力改善，eNos表達增強，NO的合成分泌增加。提示他汀類藥物能增加內皮祖細胞數量并改善其增殖、遷移、黏附及分泌NO等能力。本實驗提示，他汀類藥物增加內皮祖細胞數量以及改善內皮祖細胞功能的作用可能是其對整個血管內皮功能改善的重要組成部分，是其防治冠心病、腦梗死等缺血性疾病的新依據。

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（收稿日期：2012-12-24）