青霉素酶對青霉素殘留生乳檢測結果的影響

吳桂蘭 李秀明 何曉蕾 李丹丹 邱立明

摘要：本文對青霉素酶對青霉素殘留生乳檢測結果的影響進行了簡要分析。

關鍵詞：青霉素酶“解抗劑”生乳檢測

0 引言

乳制品在人們日常生活中占據(jù)著日益重要位置的同時其安全問題也越來越引起人們的重視[1]。在眾多不安全因素中，抗生素殘留由于會造成耐藥菌傳播，對飲用者身體健康造成不利的影響，已經引起各方關注[2]。目前市場上無抗和有抗奶的收購價差異較大，為了掩蓋生乳中的抗生素殘留，“解抗劑”也相應有了廣泛的市場。所謂“解抗劑”，主要是指β-內酰胺酶類可以選擇性分解β-內酰胺類抗生素的一種蛋白。它可以在短時間內分解牛乳中的抗生素殘留，使抗生素殘留奶通過檢測[3]。在實際生產中，很多乳品生產廠家利用抗生素殘留檢測和乳酸菌類在有抗生素殘留的牛乳中不發(fā)酵或異常發(fā)酵的情況判定生乳是否含有抗生素[1]。那采用“解抗劑”處理過的抗生素殘留奶能否通過相應檢測呢？本次試驗旨在探討β-內酰胺酶對抗生素殘留生乳檢測結果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 ①菌株。藤黃微球菌( Micrococcus Luteus )CMCC(B)28001購自國家醫(yī)學菌種保藏管理中心。乳酸菌YO-MIX 495 LYO100DCU購自丹尼斯克公司（中國代理）。②試劑與培養(yǎng)基。青霉素鈉（4000000U/支），山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；β-內酰胺酶標準品（4000000U/mL），中國藥品生物制品檢定所；抗生素快速檢測試紙條，twin-sensor。③生乳。無抗生素生乳采自山東銀香偉業(yè)集團有限公司自控養(yǎng)殖小區(qū)。

1.2 方法 ①青霉素溶液配制。用10ml生理鹽水完全稀釋1支400萬單位的青霉素鈉，即得到400000U/ml的青霉素溶液。②抗生素殘留的檢測。取10支試管進行標記，分別加入20ml無抗生素生乳，煮沸5min冷卻后在2-10支試管中分別加入1ml青霉素溶液。再向3-10號試管中依次加入不同含量的β-內酰胺酶，立即進行抗生素殘留檢測。于37℃溫育30min再次進行檢測。抗生素殘留檢測按照twin-sensor試劑盒說明書進行。③杯碟法進行β-內酰胺酶的檢測[4]。按照下列順序分別將青霉素標準溶液（0.1mg/mL）、β-內酰胺酶標準溶液（16000U/mL）、舒巴坦標準溶液（1 mg/mL）加入到樣品和純水中：(A)青霉素5μL；(B)舒巴坦25μL、青霉素5μL；(C)β-內酰胺酶25μL、

青霉素G5μL；(D)β-內酰胺酶25μL、舒巴坦25μL、青霉素5μL。并將上述A～D試樣各200μL加入放置于培養(yǎng)基上的4個牛津杯中，37℃培養(yǎng)20h后測量抑菌圈直徑并對結果進行判定。④生乳發(fā)酵。在上述10支試管中分別加入0.6ml乳酸菌，混勻后于42℃水浴發(fā)酵。

2 結果

2.1 β-內酰胺酶對青霉素的分解作用 10支生乳加入β-內酰胺酶后立即進行抗生素檢測，結果如圖1.A所示：1為陰性，2為陽性，3-5為陽性，6為弱陽性，7-10為陰性，此現(xiàn)象說明含量高于等于150萬單位的β-內酰胺酶在常溫下可以迅速降解40萬單位的青霉素。溫育30min后，再次對10支試管中的牛奶進行抗生素檢測，結果如圖1.B所示：1為陰性，2為陽性，3-4為陽性，5為弱陽性，6-10為陰性，此現(xiàn)象說明β-內酰胺酶在適宜的溫度條件下水解能力會增強，含量高于等于80萬單位的酶在37℃下作用30min可以降解40萬單位的青霉素。

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2.2 β-內酰胺酶對抗生素牛奶發(fā)酵結果的影響 對10支試管中的乳品進行發(fā)酵試驗，發(fā)酵2.5h，5h，7.5h，10h，24h各對其進行一次觀測，發(fā)酵結果如表1所示。由圖2可以看出：發(fā)酵2.5h時1已完全發(fā)酵，2-8未發(fā)酵，9-10 未完全發(fā)酵（圖2，B）；發(fā)酵5h時1發(fā)酵，2、3未發(fā)酵，4未完全發(fā)酵，5-10 完全發(fā)酵（圖2，C）；7.5h時，1發(fā)酵，2未發(fā)酵，3未完全發(fā)酵，4-10 完全發(fā)酵（圖2，D）；10h和24h時，除陽性對照2未發(fā)酵，其他樣品均已完全發(fā)酵（圖2，E，F(xiàn)）。

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2.3 β-內酰胺酶的檢測 采用杯碟法對無抗生素生乳1號樣品與經β-內酰胺酶分解過的抗生素生乳5號樣品進行β-內酰胺酶的檢測，同時用純水作為對照，其檢測結果如圖3所示：

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經過對抑菌圈的測量，可以看出5號樣品中(B)和(D)均產生抑菌圈，且(C)與(D)抑菌圈差異在3mm以上(含3mm)時，(A)的抑菌圈小于(B)的抑菌圈差異在3mm以上(含3mm)即5號檢出β-內酰胺酶；1號樣品中(A)的抑菌圈同(B)的抑菌圈差異小于3mm，說明未添加有β-內酰胺酶，結果與前期試驗吻合。

3 討論

3.1 牛奶抗生素快速檢測和發(fā)酵試驗的結果顯示 在添加抗生素的牛奶中加入β-內酰胺酶進行分解后，添加過抗生素的生乳可以通過抗生素快速檢測并完成發(fā)酵試驗。這說明β-內酰胺酶對抗生素殘留奶的掩蔽作用比較明顯，只通過抗生素檢測和發(fā)酵試驗并不能真正意義上杜絕抗生素殘留奶，因此乳品企業(yè)在實際工作中不能只采用抗生素快速檢測和牛奶發(fā)酵試驗的方法對牛奶中是否添加抗生素進行判定，還需要輔以其他檢測手段，尤其要加強對β-內酰胺酶等解抗劑的檢測[5]。

3.2 畜牧業(yè)在近年來迅速發(fā)展，牛奶作為營養(yǎng)最全面、消化率最高、鈣含量豐富的食品之一，受到消費者的歡迎[6]，同時其質量及其安全性也倍受關注。牛奶中殘留抗生素會危害飲用者身體健康，而非法添加解抗劑掩蔽牛奶中的抗生素可能助長牛奶生產中β-內酰胺類抗生素的濫用，這會加速耐藥菌的傳播[7]，與人體直接濫用抗生素的危害類似，甚至更加嚴重。因此，我們不但要關注牛奶中的抗生素殘留，更要加強對“解抗劑”的關注，嚴把質量關，帶給消費者真正健康、安全的乳品。

參考文獻：

[1]曹亢，曹雪，任發(fā)政.牛奶中抗生素殘留檢測方法的研究進展及展望[J].中國乳業(yè)，2009(09).

[2]孟靜，王銳，祝建華.生鮮牛乳中抗生素檢測方法的新問題[J].中國乳品工業(yè)，2010(9).

[3]孟靜，王銳.霍勝楠等.分解酶對牛乳中抗生素檢測的影響[J].食品研究與開發(fā)，2011(6).

[4]米自由，蘇亮，何義剛等.生鮮牛乳中l(wèi)3一內酰胺酶檢測方法一杯碟法的優(yōu)化及應用[J].中國獸醫(yī)雜志，2010(1).

[5]張鑫瀟，謝巖黎，王金水等.牛乳中β-內酰胺酶的檢測方法研究進展[J].中國乳品工業(yè)，2011(2).

[6]鄭靖宇.牛乳營養(yǎng)價值淺析[J].農民致富之友，2011(20).

[7]Essack S Y，Hall L M，Pillay D G，et a1.Complexity and diversity of Klebsiella pneumoniae strains with extended-spectrmn beta-lacta2 mases isolated in 1994 and 1996 at a teaching hospital in Durban，South Africa[J].Antimicrob Agents Chemother，2001(1).