旋光法研究L-半胱氨酸在食品加工條件下的穩(wěn)定性*

葉麗君，黃雪松

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州，510632)

L-半胱氨酸(L-Cysteine，L-Cys;L-α-氨基-β-巰基丙酸)，比旋光度［α］20D=+6.5°(5 mol/L HCl中);L-Cys具有還原性基團(tuán)巰基(—SH)，在中性或微堿性水溶液能被空氣氧化成L-胱氨酸(L-Cystine，L-Cys-Cys)，酸性溶液較為穩(wěn)定［1］。L-Cys是蛋白質(zhì)、酶等生物活性物質(zhì)的組成成分之一，具有多種生理活性［2－3］。在食品、藥品中有抗氧化和防止非酶褐變作用，常用作抗氧化劑或營養(yǎng)強(qiáng)化劑。由于L-Cys在醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)中被廣泛地運(yùn)用，了解L-Cys其加工、貯運(yùn)中穩(wěn)定性或變化規(guī)律，對于發(fā)揮L-Cys的作用和保證有關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量則極為必要。

檢測L-Cys含量的方法主要有電分析化學(xué)法、高效液相色譜法、自動(dòng)分析儀法、化學(xué)滴定法、旋光度法和紫外分光光度法等［4－5］。這些測定方法需要專門儀器，操作繁瑣，難以測定L-Cys在相關(guān)產(chǎn)品、尤其在食品加工條件下的變化過程。本研究根據(jù)多組分旋光物質(zhì)體系的旋光度具有加和性這一特性，測定LCys在常溫下、有氧和無氧溶液、H2O2、NaHSO3存在下和不同溫度下的旋光度變化，探討L-Cys在加工過程中的變化規(guī)律，為加工過程中減少L-Cys的變化提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

WZZ-2B自動(dòng)旋光儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH-4恒溫水浴鍋，江蘇金壇市宏華儀器廠。L-半胱氨酸鹽酸鹽(L-Cys·HCl，食品級，含量 ＞98%)，廣東大地食用化工有限公司;L-胱氨酸(優(yōu)級純)，上海索萊寶生物科技有限公司;HCl，Na2HPO4，檸檬酸，H2O2，Na2SO3均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

Mcllvaine緩沖溶液的配制，見參考文獻(xiàn)［6］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 L-Cys和L-Cys-Cys在不同pH值溶液中比旋光度的測定

稱取5.00 g L-Cys·HCl于具塞試管中，分別加入pH 3.0～8.0的Mcllvaine緩沖溶液，定容至25 mL。以相應(yīng)的pH值緩沖溶液為空白調(diào)零，測定各個(gè)pH值下溶液的旋光度，并計(jì)算各自比旋光度和摩爾旋光度。

稱取2.00 g L-Cys-Cys，用1 mol/L HCl定容至100 mL。取5 mL L-Cys-Cys溶液中，分別加入pH 3.0～8.0的Mcllvaine緩沖溶液，定容至25 mL。以相應(yīng)的pH緩沖溶液為空白調(diào)零，測定各個(gè)pH值下溶液的旋光度，并計(jì)算各自比旋光度和摩爾旋光度。

1.2.2 測定L-Cys在不同pH值下的旋光度

稱取5.00 g L-Cys·HCl于具塞試管中，分別加入pH 3.0～8.0的Mcllvaine緩沖溶液，定容至25 mL。在暴露于空氣的條件下，每隔1 h測定各個(gè)pH值下溶液的旋光度，確定L-Cys最穩(wěn)定時(shí)所對應(yīng)的pH值。

1.2.3 溶液中溶氧對L-Cys旋光度的影響

分別稱取5.00 g L-Cys·HCl于2支具塞試管中，各加入由1.2.2所確定的pH值且經(jīng)過煮沸后冷卻和搖晃5 min以充分溶氧的Mcllvaine緩沖溶液，分別定容至25 mL。在隔絕空氣的條件下，每隔1 h，測定各自旋光度。

1.2.4 配制指定pH值的L-Cys溶液

稱取5.00 g L-Cys·HCl于具塞試管中，加入由1.2.2所確定的pH值的Mcllvaine緩沖溶液，定容至25 mL。

1.2.5 H2O2對L-Cys旋光度的影響

在根據(jù)1.2.4所配制的的L-Cys溶液中加入0.1 mL 30%H2O2后、在隔絕空氣的條件下，立即測定其旋光度，然后每隔5 min測定其旋光度。

1.2.6 NaHSO3對L-Cys旋光度的影響

在根據(jù)1.2.4所配制的的 L-Cys溶液中加入0.10 g NaHSO3，在暴露于空氣的條件下，每隔1 h測定其旋光度。

1.2.7 溫度對L-Cys旋光度的影響

將1.2.4所配制的的L-Cys溶液分別于60℃和100℃的恒溫條件下，每隔15 min測定其旋光度。

1.3 旋光度、反應(yīng)速率常數(shù) k和半衰期 t1/2的計(jì)算［7］

根據(jù)旋光度的加和性，推導(dǎo)L-Cys和L-Cys-Cys兩者的旋光度與各自濃度的計(jì)算公式分別為:

式中c0，c1和 c2分別表示 L-Cys的初始濃度，LCys-Cys和L-Cys-Cys的最終濃度的濃度(mol/L)，M摩爾比旋光度(其為比旋光度［α］和摩爾質(zhì)量Mr的乘積)。

以c對t作圖，所得函數(shù)曲線的斜率即為反應(yīng)速率常數(shù) k［mol/(dm3·h)］，即:

式中:c是L-Cys的濃度(mo/L);t是反應(yīng)時(shí)間(h);a為所得函數(shù)曲線在縱坐標(biāo)上的截距，為常數(shù);t1/2為半衰期(h)。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-Cys和L-Cys-Cys在不同pH值下的比旋光度

L-Cys和L-Cys-Cys在不同pH值下的比旋光度變化結(jié)果分別見圖1。由圖1可知，L-Cys和L-Cys-Cys的比旋光度均隨著pH值升高而降低，且其變化規(guī)律分別符合一次函數(shù):［α］=－0.434(pH)－6.69(R2=0.985)和［α］= －11.73(pH)－192.6(R2=0.942)。t檢驗(yàn)(P=0.01，n=6)表明，這2個(gè)方程可反映 L-Cys和 L-Cys-Cys隨 pH值變化的規(guī)律［8］。因?yàn)長-Cys和L-Cys-Cys是具有酸堿兩性的氨基酸，pH值不同，其電離度、分子構(gòu)象不同，而分子構(gòu)象決定旋光性物質(zhì)的旋光度［9－10］，所以pH影響其比旋光度的大小。因此，在研究L-Cys和L-Cys-Cys時(shí)，不應(yīng)忽略它們隨pH值而變化的影響。

圖1 L-Cys和L-Cys-Cys在不同pH值下的比旋光度變化規(guī)律Fig.1 Specific rotation changes of L-Cys in different pH values

2.2 室溫下L-Cys在不同pH值下的氧化破壞

由圖2可見，pH 3.0～8.0時(shí)，隨著時(shí)間的增加，L-Cys的濃度降低;L-Cys的氧化符合零級反應(yīng)，即其反應(yīng)速率與反應(yīng)物的濃度無關(guān)［7］。根據(jù)式1和式2式計(jì)算L-Cys在pH 3.0～8.0緩沖溶液中的氧化動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1。L-Cys的氧化屬于非酶化學(xué)反應(yīng)，應(yīng)當(dāng)符合質(zhì)量作用定律。以L-Cys濃度c對時(shí)間t作圖，得直線(如圖2)。

圖2 pH 3.0～8.0時(shí)L-Cys的氧化曲線Fig.2 Oxidation curves of L-Cys at pH 3.0～8.0

由表1可知，L-Cys在不同pH值下的氧化符合零級反應(yīng)。其中在pH 3.0時(shí)，L-Cys的氧化反應(yīng)速率常數(shù)最小，為 2×10－7mol/(dm3·h)，半衰期最長，為2.76×106h;在pH 4.0和pH 8.0時(shí)，L-Cys的氧化反應(yīng)速率常數(shù)均達(dá)到最大，為9×10－7mol/(dm3·h)，是L-Cys在pH 3.0的緩沖溶液中的氧化反應(yīng)速率常數(shù)的4.5倍，而半衰期分別為6.13×105h和6.23×105h。

表1 常溫下L-Cys在不同pH值的緩沖溶液中的氧化動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of oxidation of L-Cys in different pH values at room temperature

2.3 溶液中溶氧對L-Cys氧化破壞的影響

溶液(pH 3.0)是否溶氧對L-Cys氧化的影響如圖3所示。L-Cys在溶液中有氧和無氧時(shí)，其氧化破壞均符合零級反應(yīng)。溶液中是否溶氧影響L-Cys濃度，但對L-Cys的氧化速率幾乎無影響，二者氧化速率常數(shù)均為2×10－7mol/(dm3·h)，這可能是由于在有氧溶液中，L-Cys一開始便迅速與其中的氧氣反應(yīng)生成L-Cys-Cys，所以在溶液無氧時(shí)較有氧時(shí)的濃度高。同時(shí)有氧溶液中氧氣幾乎被耗盡，其體系近似于無氧溶液體系;而二者均是在隔絕外界氧氣的條件下測定的(見1.2.3)，所以L-Cys在有氧和無氧溶液中的氧化速率常數(shù)相等。此外根據(jù)1.2.2和圖2可知，即使L-Cys溶液在暴露于外界空氣時(shí)測定，其氧化速率常數(shù)仍為2×10－7mol/(dm3·h)，由此推測L-Cys的氧化可能與溶氧速率有關(guān)。可見，在實(shí)際生產(chǎn)中，在pH 3.0、常溫的體系中存在L-Cys，若避免加快溶氧速率的操作(如避免攪拌、隔氧等措施)，體系中的L-Cys可穩(wěn)定存在。

圖3 溶液中有氧無氧時(shí)L-Cys氧化曲線(pH 3.0)Fig.3 Oxidation curves of L-Cys in aerobic and anaerobic solutions(pH 3.0)

2.4 H2O2對L-Cys的氧化破壞

圖4－(a)是pH 3.0、溶液中加入H2O2后L-Cys的氧化情況，即加入H2O2后，L-Cys溶液迅速被氧化成L-Cys-Cys;隨時(shí)間增加、H2O2被逐漸消耗完，LCys濃度降低的速率減小。根據(jù)圖4－(a)的曲線可見，在0～0.42 h時(shí)，體系中L-Cys的濃度變化接近一條直線。為便于比較，將0～0.42 h的L-Cys溶液氧化反應(yīng)初期的數(shù)據(jù)按零級反應(yīng)處理(見圖4－(b))，L-Cys的氧化反應(yīng)速率常數(shù)從未添加H2O2時(shí)(見表1)的2 ×10－7mol/(dm3·h)增加至9 ×10－6mol/(dm3·h)，反應(yīng)速率是未添加H2O2的45倍，半衰期由2.76×106h減少至6.10×104h。這主要是因?yàn)檫^氧化氫的氧化還原電位Eθ(H2O2/H2O)=+1.77 V，而 O2的氧化還原電位 Eθ(O2/H2O)= +0.816 V，前者比后者大得多［11－12］。所以在本試驗(yàn)中，L-Cys溶液加入H2O2后是隔絕外界空氣進(jìn)行測定的，但是其氧化反應(yīng)速率常數(shù)仍比未添加H2O2、暴露于外界空氣時(shí)的大得多。

2.5 NaHSO3對L-Cys的氧化破壞

圖5是pH 3.0、溶液中存在NaHSO3時(shí)L-Cys的氧化破壞情況。由圖5和 圖2可見，當(dāng)溶液中添加NaHSO3后，L-Cys的氧化反應(yīng)速率常數(shù)是未添時(shí)的10倍，為2×10－6mol/(dm3·h)，其半衰期為2.76×105h。可見NaHSO3對L-Cys氧化成L-Cys-Cys的反應(yīng)具有促進(jìn)作用。這主要是由于Eθ(L-Cys-Cys/LCys)=－0.34 V，而在酸性溶液中，HSO3－以H2SO3的形式存在，Eθ(H2SO3/HS2O4－)= －0.08 V，表明L-Cys的還原性大于 H2SO3。根據(jù) Eθ(H2SO3/HS2)－ Eθ(L-Cys-Cys/L-Cys)=+0.26 V ＞ +0.2 V，體系中可能發(fā)生反應(yīng):2L-Cys+H2SO3→ L-Cys-Cys+HS2O4－+H2O+H+，從而促使L-Cys氧化成 L-Cys-Cys［11，12］。而在本試驗(yàn)中，加有 NaHSO3的L-Cys溶液在是暴露于外界空氣下測定的，空氣中氧氣加上NaHSO3的雙重氧化作用，使L-Cys的氧化速率常數(shù)增加。NaHSO3和L-Cys在食品生產(chǎn)中都可用作抗氧化劑［13］，據(jù)上述結(jié)果與分析可見，NaHSO3會加速L-Cys的氧化，不能作為保護(hù)L-Cys的抗氧化劑使用。

圖4 H2O2存在時(shí)L-Cys氧化破壞曲線(pH 3.0)Fig.4 Oxidation curve of L-Cys in solution containing H2O2(pH 3.0)

圖5 NaHSO3存在時(shí)L-Cys氧化降解曲線(pH 3.0)Fig.5 Oxidation curve of L-Cys in solution containing NaHSO3(pH 3.0)

2.6 溫度對L-Cys的影響

根據(jù)旋光度的加和性可知，L-Cys被氧化生成LCys-Cys，其混合液總旋光度應(yīng)減小。但由圖6可見，pH 3.0、在加熱條件下，L-Cys溶液的總旋光度不隨時(shí)間增加而逐漸減小，而是出現(xiàn)無規(guī)律的變化。這說明在加熱條件下，尤其是加熱至100℃ 時(shí)，L-Cys不僅發(fā)生氧化反應(yīng)生成L-Cys-Cys，而可能發(fā)生其他化學(xué)反應(yīng)形成不同的物質(zhì)，因而導(dǎo)致其旋光度出現(xiàn)不規(guī)律變化。L-Cys具有熱不穩(wěn)定性，其水溶液加熱至100℃以上會發(fā)生熱降解反應(yīng)，根據(jù)溶液pH值不同生成不同物質(zhì)，如160℃時(shí)，在pH 2.2時(shí)會主要生成噻吩硫醇、三噻環(huán)庚烯等，在pH 5.1和pH 7.1時(shí)則主要生成2-甲基三硫化合物［14－16］。在本實(shí)驗(yàn)條件下，雖然加熱沒超過100℃，但通過L-Cys溶液旋光度變化可知，L-Cys在加熱至60℃時(shí)開始呈現(xiàn)不穩(wěn)定性，不是只氧化生成L-Cys-Cys。當(dāng)加熱至100℃時(shí)，溶液總旋光度變化幅度更大，更無規(guī)律，說明L-Cys可能發(fā)生了熱降解，生成了其他復(fù)雜的化合物而非單純的L-Cys-Cys，所生成的其他化合物又有各自的旋光度，導(dǎo)致體系的總旋光度不如預(yù)期般逐漸減小。

圖6 溫度對L-Cys旋光度的影響(pH 3.0)Fig.6 The influence of temperature to optical activity of L-Cys(pH 3.0)

3 結(jié)論

L-Cys和L-Cys-Cys的比旋光度和pH值的關(guān)系呈極顯著正相關(guān)，分別符合一次函數(shù):［α］=－0.434(pH)－6.69(R2=0.985)和［α］= －1.73(pH)－192.6(R2=0.942)。在pH值3.0～8.0內(nèi)，L-Cys的氧化反應(yīng)符合零級反應(yīng)，其氧化反應(yīng)速率常數(shù)在pH 3.0時(shí)最小，在pH 4.0和pH 8.0時(shí)均達(dá)到最大。溶液中是否有氧會影響L-Cys的起始濃度，其濃度在無氧溶液中比在有氧溶液中高，但是不會影響其氧化速率常數(shù)。溶液中存在H2O2時(shí)使L-Cys的氧化速率常數(shù)增大，促進(jìn)其氧化形成L-Cys-Cys。溶液中加入NaHSO3后，在空氣中氧和 NaHSO3的雙重氧化作用下，L-Cys溶液的氧化速率常數(shù)是未加NaHSO3的10倍，因此NaHSO3不能作為保護(hù)L-Cys的抗氧化劑。L-Cys具有熱不穩(wěn)定性，當(dāng)加熱至60℃時(shí)其溶液總旋光度開始出現(xiàn)無規(guī)律變化，其化學(xué)結(jié)構(gòu)被破壞;當(dāng)加熱至100℃時(shí)，其溶液總旋光度變化更不規(guī)則，L-Cys可能發(fā)生熱降解產(chǎn)生多種化合物。

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