消化道中燕麥β-葡聚糖對(duì)EGCG吸附作用的體外研究*

馬雅欽，高瑞萍，2，崔峻，趙國(guó)華，3

1(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(遵義醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 遵義，563000)3(重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，400715)

目前，膳食纖維與功能小分子相互作用研究成為熱點(diǎn)。多糖和多酚可以通過氫鍵、疏水相互作用等結(jié)合［1］。許多多糖能與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合多酚［2］，形成的多糖多酚復(fù)合物能為機(jī)體提供更持久的抗氧化能力［3］。燕麥β-葡聚糖是以細(xì)胞壁非淀粉多糖的形式存在的可溶性膳食纖維，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能［4］、抗腫瘤活性［5］、降低膽固醇和血脂以及調(diào)節(jié)血糖［5－6］等方面起重要作用［7］，具有較強(qiáng)的吸附小分子的能力。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是茶多酚中主要功能成分，具有增強(qiáng)機(jī)體抵抗力、抗氧化性、抗癌、降血糖血脂等生理功能［8－10］。前期研究表明，β-葡聚糖可主要通過氫鍵等作用力吸附茶多酚形成復(fù)合物［11］，并且在合適濃度下二者的復(fù)合作用在產(chǎn)物的抗氧化影響上表現(xiàn)為增效作用［12］。影響胃腸液中β-葡聚糖吸附EGCG的因素尚不清楚。利用燕麥β-葡聚糖和EGCG為試驗(yàn)材料，模擬胃腸液反應(yīng)環(huán)境，探討胃腸液中胃蛋白酶、胰蛋白酶、pH值和EGCG濃度對(duì)燕麥β-葡聚糖吸附EGCG的影響，以期探討體內(nèi)β-葡聚糖吸附EGCG的生物學(xué)作用。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

燕麥β-葡聚糖，鄭州荔諾生物科技公司;EGCG:杭州禾田生物科技有限公司;胃蛋白酶(1∶10 000)、胰蛋白酶(1∶1 000)，Sigma公司。色譜甲醇，天津四友化學(xué)試劑有限公司;其他試劑均為分析純，購(gòu)于成都科龍?jiān)噭┯邢薰尽?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

WS－26恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;PB－10標(biāo)準(zhǔn)型電化學(xué)分析儀/pH計(jì)(酸度計(jì))，德國(guó)賽多利斯公司;ALPHA 1-4/2-4LSC真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)christ公司;高效液相色譜儀，日本島津公司LC-20A;色譜柱，Thermo公司(Hypersil BDS)(4.6 mm ×250 mm)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模擬胃腸液的制備

參照Hussain等［13］的方法配制胃腸液。胃液:稱取3.2 g胃蛋白酶和7 mL 37%HCl加入1 L的容量瓶，用超純水定容;腸液:稱取6.8g KH2PO4溶于1 L超純水，加入3.2 g胰蛋白酶，NaOH調(diào)節(jié)至pH 6.8。不含胃蛋白酶的模擬胃液:7 mL 37%HCl加入1 L的容量瓶，用超純水定容;不含腸蛋白酶的模擬腸液:稱取6.8 gKH2PO4溶于超純水中，用1 L容量瓶加入超純水定容，NaOH調(diào)節(jié)至pH 6.8。

1.3.2 EGCG測(cè)定及葡聚糖對(duì)EGCG吸附量計(jì)算

游離的EGCG采用HPLC方法測(cè)定。色譜柱為Hypersil BDS(4.6 mm×250 mm)。流動(dòng)相 A為100%甲醇，流動(dòng)相B為2%乙酸溶液，采用等度洗脫10 min，流動(dòng)相甲醇(A)，2%的乙酸(B)，體積比為25∶75，流速0.9 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm。葡聚糖對(duì)EGCG的吸附量用如下公式表示:Q=(c1V－c2V)/m。

式中:Q表示葡聚糖對(duì) EGCG的吸附量(μg/mg);c1表示吸附前EGCG的濃度(μg/mL);c2表示吸附后EGCG的濃度(μg/mL)(HPLC測(cè)定可得);m表示葡聚糖的量(mg);V表示溶液的體積。

1.3.3 胃蛋白酶、胰蛋白酶對(duì)β-葡聚糖吸附EGCG的影響

分別稱取12.5 mg EGCG和12.5 mg葡聚糖溶于含胃蛋白酶、胰蛋白酶和不含胃蛋白酶、胰蛋白酶的pH 1.5胃液和pH 6.8的腸液中，37℃保溫30～180 min，間隔時(shí)間30 min。經(jīng)0.45 μm濾膜后HPLC測(cè)定。β-葡聚糖對(duì)EGCG的吸附量參照1.3.2計(jì)算公式得出。

1.3.4 模擬胃腸液的pH對(duì)葡聚糖吸附EGCG的影響

用HCl和NaOH對(duì)模擬胃腸液的pH進(jìn)行調(diào)節(jié)，使胃液 pH值為1.5～4.0，腸液 pH值5～8，稱取12.5 mg EGCG和葡聚糖分別溶于25 mL不同pH值的胃液和腸液配成0.5 mg/mL的溶液，搖勻，于37℃保溫180 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后測(cè)定游離的EGCG濃度。β-葡聚糖對(duì)EGCG的吸附量參照1.3.2計(jì)算公式得出。

1.3.5 EGCG濃度對(duì)胃腸液中葡聚糖吸附EGCG的影響

分別稱取 12.5、15、17.5、20、22.5、25 mg EGCG和12.5 mg葡聚糖溶于25 mL pH 1.5的胃液和25 mL pH 6.8的腸液配制成EGCG濃度為0.5～1.0 mg/mL，葡聚糖濃度為0.5 mg/mL的胃液和腸液，于37℃保溫180 min。經(jīng)0.45 μm濾膜后HPLC測(cè)定游離EGCG濃度。β-葡聚糖對(duì)EGCG的吸附量參照1.3.2計(jì)算公式得出。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理方法

以上試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示。并利用SPSS分析數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行顯著性分析，最后運(yùn)用origin作圖軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 胃蛋白酶、胰蛋白酶對(duì)β-葡聚糖吸附EGCG的影響

由圖1可看出，總體而言含胃蛋白酶的胃液中β-葡聚糖對(duì)EGCG吸附比不含胃蛋白酶的胃液吸附量大，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸附量均逐漸增大，當(dāng)時(shí)間為120 min時(shí)，含胃蛋白酶和不含胃蛋白酶的模擬胃液中的吸附量基本相等。由于多糖與蛋白質(zhì)在吸附小分子物質(zhì)方面存在競(jìng)爭(zhēng)性。所以胃蛋白酶的加入可能與β-葡聚糖競(jìng)爭(zhēng)性吸附EGCG，胃蛋白酶吸收一部分EGCG，而使得游離EGCG減少，故而顯示出β-葡聚糖對(duì)EGCG的吸附量增大。

圖1 模擬胃液中胃蛋白酶對(duì)β-葡聚糖吸附EGCG的影響Fig.1 The influence of pepsin on the adsorption of EGCG onto β-glucan in simulated gastric juice

由圖2可看出，含胰蛋白酶的腸液中β-葡聚糖對(duì)EGCG吸附比不含胰蛋白酶的腸液吸附明顯增大，且隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)吸附量也逐漸增大。可能的原因是胰蛋白酶作為一種蛋白質(zhì)，它的加入可能與β-葡聚糖競(jìng)爭(zhēng)性吸附EGCG，使得游離EGCG含量減少，吸附量增大。也有可能是胰蛋白酶的加入使得β-葡聚糖活性位點(diǎn)發(fā)生改變，促進(jìn)了 β-葡聚糖對(duì)EGCG的吸附。

圖2 模擬腸液中胰蛋白酶對(duì)葡聚糖吸附EGCG的影響Fig.2 The influence of trypsin on the adsorption of EGCG onto β-glucan in simulated intestinal juice

由圖1和圖2可以看出，在含有蛋白酶的胃腸液中β-葡聚糖對(duì)于EGCG吸附量高于不含蛋白酶的EGCG吸附量。在進(jìn)食的情況下，機(jī)體分泌胃蛋白酶和腸蛋白酶的量都會(huì)增加。所以從蛋白酶對(duì)葡聚糖吸附EGCG的影響看，進(jìn)食會(huì)有利于EGCG的吸附。

2.2 模擬胃腸液的pH值對(duì)葡聚糖吸附EGCG的影響

如圖3所示，在模擬胃液中，隨著胃液的pH值逐漸增大，β-葡聚糖對(duì)EGCG的吸附量增大。pH值低于3.0時(shí)，吸附量處于較低的水平;當(dāng)pH值高于3.0時(shí)，EGCG吸附量增加顯著，且在pH值為3.5和4.0時(shí)無顯著性差異。低pH值時(shí)的吸附量較少的原因可能是燕麥β-葡聚糖在酸性環(huán)境下容易發(fā)生水解以及低pH值導(dǎo)致β-葡聚糖構(gòu)象發(fā)生變化。一般禁食狀態(tài)下胃液的pH值為1.5左右，由于進(jìn)食會(huì)導(dǎo)致胃液pH值增大［14］，所以可以推斷進(jìn)食狀態(tài)β-葡聚糖對(duì)EGCG的吸附量較大。

圖3 模擬胃液pH對(duì)葡聚糖吸附EGCG的影響Fig.3 The effects of the pH of simulated gastric juice on the adsorption of EGCG onto β-glucan

如圖4所示，在體外模擬腸液中，隨著腸液pH值增大(5.0～7.5)，β-葡聚糖對(duì)EGCG的吸附逐漸增大，當(dāng)pH 6.5時(shí)吸附量最大，隨后降低。分析原因可能是EGCG在偏堿性條件下不穩(wěn)定，部分EGCG發(fā)生氧化而導(dǎo)致響應(yīng)因子減少，導(dǎo)致吸附量降低［15］。

圖4 模擬腸液pH對(duì)葡聚糖吸附EGCG的影響Fig.4 The effects of the pH of simulated intestinal juice on the adsorption of EGCG onto β-glucan

由圖3和圖4可以看出，pH值對(duì)胃腸液中β-葡聚糖吸附EGCG有顯著影響，這主要是因?yàn)閜H值的改變會(huì)影響β-葡聚糖和EGCG單體的穩(wěn)定性，導(dǎo)致響應(yīng)物質(zhì)含量改變，使得β-葡聚糖-EGCG復(fù)合物的生成量產(chǎn)生變化。這為將來研究β-葡聚糖-EGCG復(fù)合物包埋后在胃腸道中的釋放提供參考。

2.3 模擬胃腸液的EGCG濃度對(duì)β-葡聚糖吸附EGCG的影響

如圖5所示，β-葡聚糖對(duì)EGCG的吸附量隨著EGCG的濃度增大而逐漸增大。濃度在低于0.6 mg/mL時(shí)，吸附量處于低水平;在高于0.6 mg/mL時(shí)，β-葡聚糖對(duì)EGCG的吸附量與EGCG濃度呈線性相關(guān)。圖5中可看出，EGCG濃度對(duì)吸附具有較大的影響，故可以通過提高EGCG的濃度來提高β-葡聚糖對(duì)EGCG吸附量。

圖5 模擬胃液中EGCG濃度對(duì)β-葡聚糖吸附EGCG的影響Fig.5 The effect of the EGCG concentration on the adsorption of EGCG onto β-glucan in simulated gastric juice

如圖6所示，隨著EGCG濃度增大，β-葡聚糖對(duì)EGCG的吸附量逐漸增大，濃度在0.7～0.8 mg/mL之間增幅較平緩，但存在顯著性差異。可以通過提高EGCG的濃度來提高體外模擬腸液中 β-葡聚糖對(duì)EGCG吸附量，為體內(nèi)研究提供參考。

圖6 模擬腸液的EGCG濃度對(duì)β-葡聚糖吸附EGCG的影響Fig.6 The effect of the EGCG concentration on the adsorption of EGCG onto β-glucan in simulated intestinal juice

由圖5和圖6可以看出，EGCG濃度的升高與胃液和腸液中的β-葡聚糖對(duì)EGCG的吸附量增大呈正相關(guān)。原因是可能是β-葡聚糖和EGCG主要通過氫鍵相結(jié)合［11］，EGCG濃度的增加，增加了EGCG響應(yīng)因子的數(shù)量，與β-葡聚糖結(jié)合機(jī)率提高，使得吸附量增大。

3 結(jié)論

對(duì)體外模擬胃腸液中燕麥β-葡聚糖吸附EGCG的影響因素進(jìn)行研究，結(jié)果表明模擬胃腸液中胃蛋白酶、胰蛋白酶、pH值、EGCG濃度等因素的改變會(huì)影響燕麥β-葡聚糖對(duì)于EGCG的吸附量。加入胃蛋白酶和胰蛋白酶，由于蛋白酶和燕麥β-葡聚糖存在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合關(guān)系，故使EGCG吸附量增大。pH值的改變，影響燕麥β-葡聚糖和EGCG的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象穩(wěn)定，對(duì)燕麥β-葡聚糖吸附能力產(chǎn)生較大影響:模擬胃液中隨pH值升高，β-葡聚糖吸附能力逐漸增強(qiáng);腸液中隨pH升高，吸附能力首先升高然后下降，pH值在6.5時(shí)，其吸附能力最大。EGCG濃度的升高，會(huì)使得EGCG作為響應(yīng)因子增多，也使β-葡聚糖對(duì)EGCG的吸附能力增強(qiáng)。

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