胡椒堿的光異構化研究*

郭墨亭，夏學進，黃雪松

1(暨南大學理工學院食品科學與工程系，廣東廣州，510632)2(廣東匯香源生物科技股份有限公司，廣東廣州，510665)

胡椒(Piper nigrum L.)屬胡椒科，是藤本植物，主產于我國海南，越南等熱帶地區，是食品工業中應用量最大的調味料。其所含有的胡椒堿(piperine)屬于酰胺類生物堿，具有鎮靜保肝、抗腫瘤［1］、免疫調節［2］、抗氧化［3］、抗潰瘍［4］、抗抑郁［5］、抗驚厥［6］、提高生物的藥物利用率［7］、刺激黑素細胞增殖［8］等生物活性，因此，為保持胡椒堿的生物活性，有必要在使用胡椒時最大限度地保持胡椒堿的穩定性。

胡椒堿分子結構中，除含有苯環、吡啶等結構外，還具有全反式共軛雙鍵等結構，由于該結構易于吸收光能而形成全順式或部分順式結構，極易使胡椒堿異構成異胡椒堿、異胡椒脂堿和胡椒脂堿［9－10］，這種分子結構的改變，必然影響到胡椒堿的理化性質或生物活性。如酰胺類化合物生物活性，就與其酰胺鍵的二面角有關，具有反式結構的桂皮酰胺類生物堿具有抗驚活性，而具有順式結構桂皮酰胺類生物堿則通常具有中樞神經興奮作用［11］。由此推測，胡椒堿及其異構體在生物活性上也應當存在一定差異。因此，有必要研究清楚光照對胡椒堿異構化的影響規律，為保持其穩定性和生物活性提供依據。本文擬以純胡椒堿為反應物，采用不同的輻照條件處理，探索胡椒堿及其異構體的光穩定性。

1 材料與方法

1.1 試劑與原料

圖1 胡椒堿及其異構體的結構Fig.1 Structures of piperine isomers

胡椒堿:購于西安華萃生物技術有限公司，純度為98%;甲醇 (色譜純)，Dima Technologic INC;乙腈(色譜純)，J B Baker USA;Na2HPO4，天津市福晨化學試劑廠。

胡椒堿異構體:參考Kozukue的方法，即通過輻照處理胡椒堿甲醇溶液，使其異構化產生異胡椒堿、異胡椒脂堿、胡椒脂堿，再經高壓液相色譜法分離得到［10］。通過電子噴霧質譜法驗證鑒定各異構體。

1.2 實驗儀器

LC－20AT高效液相色譜儀 (配備SIL－20A自動進樣器;Class-vp色譜工作站;SPD－M20A光電二極管陣列檢測器;CTO－10AS VP柱溫箱)，日本島津;0.45 μm微孔濾膜，天津津騰試驗設備有限公司;ZF-I型三用紫外分析儀(8W)，上海顧村電光儀器廠。

1.3 輻照處理

1.3.1 不同輻照時間處理

取20 mL 0.5 mg/mL胡椒堿-甲醇溶液置于培養皿中，于365 nm 紫外分析儀下每輻照0、0.25、3、6、12、24、48、72 h 后，各取 1 mL 輻照后的胡椒堿-甲醇溶液，過濾膜后注入棕色小瓶中，待HPLC檢測。

1.3.2 不同輻照波長處理

取20 mL 0.5 mg/mL胡椒堿-甲醇溶液置于培養皿中，于254 nm紫外分析儀下輻照，后續處理同1.3.1，并與365 nm輻照處理后的結果進行比較。

1.3.3 不同光源處理

分別取20 mL 0.5 mg/mL胡椒堿-甲醇溶液置于兩大小一致的培養皿中，分別置于365 nm紫外分析儀和日光燈下照射 0、1、2、3、4、5 h。后續處理同1.3.1。

1.4 高壓液相色譜(HPLC)法檢測

利用HPLC檢測上述胡椒堿異構體混合溶液，檢測條件:色譜柱:Diamonsil C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);洗脫程序:乙腈/25 mmol/L Na2HPO4(體積比60∶40)洗脫40 min;流速:0.5 mL/min;柱溫:30℃;進樣量:3 μL;檢測波長:280 nm。

依據各異構體峰面積百分比的變化，從而確定胡椒堿的消耗量及其異構體的形成量。

2 結果與討論

2.1 輻照時間對胡椒堿穩定性的影響

由圖2可看出，(1)胡椒堿的含量從輻照一開始就呈現直線下降的趨勢，大約1.8 h時消耗50%，到6 h時趨于平緩;(2)異胡椒堿和異胡椒脂堿一開始呈直線趨勢迅速形成，胡椒脂堿3 h后才開始形成，各異構體含量均在6 h后趨于平緩。說明隨著輻照時間的延長，胡椒堿及其3種異構體之間相互轉化并形成動態平衡。

圖2 輻照時間對胡椒堿穩定性的影響(365 nm)Fig.2 Effects of the radiation time on the stability of piperine ismomers(Irradiated with UV light at 365 nm)

由于雙鍵結構光異構化反應的速度是光波長和強度的函數［11］，因此，胡椒堿在受輻照的初期，其含量迅速減少;但當超過一定時間后，胡椒堿光異構化則與光照時間無關，再增加輻照時間，對胡椒堿光異構化并無太大影響。胡椒堿異構體的光異構化也呈現類似的規律。

2.2 輻照波長對胡椒堿穩定性的影響

從圖3可看出，(1)365 nm輻照72 h后，胡椒堿損耗72.84%，其3種異構體的含量為:異胡椒脂堿(31.63%)＞異胡椒堿 (26.79%)＞胡椒脂堿(14.39%)。(2)254 nm輻照72 h后，胡椒堿損耗61.55%;同時，異胡椒堿和異胡椒脂堿的形成量分別為36.15%、25.40%，胡椒脂堿未檢測出，其中，異胡椒堿的形成量高于365 nm條件下的形成量。

圖3 不同輻照波長對胡椒堿穩定性的影響Fig.3 Effects of the radiation wavelengths on the stability of piperine ismomers

胡椒堿的紫外最大吸收波長為340，365 nm較254 nm更接近該最大吸收，因而更容易引起共振并刺激胡椒堿分子結構形成不穩定高能態狀態，即更容易使胡椒堿變得不穩定而轉化成其異構體。上述結果證實了這一理論推測。

2.3 不同光源對胡椒堿穩定性的影響

由圖4可看出，(1)在日光燈和365 nm紫外燈照射的情況下，胡椒堿的消耗量相差不大，且胡椒堿及其異構體含量的變化趨勢一致;(2)但日光燈照射時，異胡椒脂堿的形成量多于365 nm紫外燈輻照的，胡椒脂堿和異胡椒堿的形成量均少于紫外燈輻照。

圖4 不同光源對胡椒堿穩定性的影響Fig.4 Effects of the light sources on the stability of piperine ismomers

根據上述分析，胡椒堿與其異構體化規律明顯;這些規律性的變化取決于其分子結構中含有的順式或反式烯烴雙鍵。根據電子激發理論，這些雙鍵的π-電子受到光激發后，會形成一個非平面的高能過渡狀態電子，同時又不斷地回到基態(平面狀態)［10］。因不同的光照處理所具有的激發能量波段不同，使得胡椒堿雙鍵的激發狀態不同，其回復到基態的速度與比率亦不相同。因此，在圖2～圖4中的輻照處理初期，胡椒堿形成異構體的速度明顯不同，胡椒堿異構化速度為輻照時間和波長的函數;但當輻照處理到足夠時間后，非平面的高能過渡狀態雙鍵與平面狀態的基態雙鍵則達到了平衡狀態時，延長光照處理時間，輻照處理胡椒堿形成異構體的速度不再變化。至于各種輻照處理能級與所形成異構體比例之間的定量關系則有待進一步研究確定。

3 結論

輻照處理胡椒堿溶液，因不同波長所具有的激發能量波段不同，使得胡椒堿雙鍵的激發狀態不同，因此，在輻照處理初期，胡椒堿異構化速度為輻照時間和波長的函數;而一段時間后，胡椒堿及其異構體相互轉化并形成動態平衡。365 nm較254 nm更接近胡椒堿的紫外最大吸收波長340 nm，更容易引起共振并刺激胡椒堿分子結構形成不穩定高能態狀態，因此365 nm輻照對胡椒堿異構化的影響比254 nm輻照大。而運用不同的光源處理，胡椒堿的損耗量差不多，但利于形成的異構體不同。因此在避光條件下有利于胡椒堿的穩定和保存。

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