混菌發酵豆豉中異黃酮含量及對小鼠肺癌細胞的抑制作用

劉錦繡，陳偉，李靖，程芳

(山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安，271018)

豆豉是我國傳統大豆發酵制品，有很高的營養價值，含有豆豉纖溶酶、大豆異黃酮、大豆低聚糖、大豆皂苷等多種功能因子，此外還含有豐富的蛋白質、多肽和氨基酸［1］。

大豆異黃酮被稱為“健康促進劑”［2］，適當地攝入能減少患乳腺癌、結腸癌、冠心病等的發病幾率［3］。研究發現，大豆異黃酮對癌細胞株有體外抗腫瘤作用，是一種潛在的抗腫瘤預防劑［4－5］。目前，普遍認為單獨服用異黃酮或配合化療可能是一種有效的抗癌方法［6－7］。大豆異黃酮分為游離型苷元和結合型糖苷兩大類。β-葡萄糖苷酶可以水解糖苷型異黃酮，使其轉化為苷元型異黃酮，更好發揮異黃酮的藥理活性并提高豆豉的抗腫瘤能力［8］。

目前國內外學者對豆豉抗腫瘤功能有所研究，但是對混菌發酵提高豆豉抗腫瘤能力的研究還不多見。本試驗從自然發酵的細菌型豆豉中篩選出高產蛋白酶的菌株(D2)［9］和產 β-葡萄糖苷酶的菌株(U35)，在單菌發酵的基礎上，進行混菌發酵，研究單菌、混菌豆豉提取物對抗腫瘤增殖的影響，并深入探討混菌豆豉異黃酮各組分含量與豆豉抗腫瘤作用的關系，以期將豆豉開發成為新一代功能性食品。

1 材料與方法

1.1 材料

LLC細胞株:小鼠肺癌細胞株，由中科院細胞庫提供;枯草芽孢桿菌D2:蛋白酶產生菌，實驗室篩選;枯草芽孢桿菌U35:β-葡萄糖苷酶產生菌，實驗室篩選;MTT:美國Invitrogen公司產品;DMEM培養基、IMDM培養基、標準胎牛血清:美國Gibco公司產品;二甲基亞砜(DMSO):北京化工廠產品。

1.2 主要儀器

SW-CL-LF凈化工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司生產;CO2孵化箱，日本SANYO公司產品;PL-2002電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司;SUNRISE酶標儀，TECAN公司產品;96孔培養板，美國eorning公司;高效液相色譜儀(包括LC－10AT泵、SPD－10A檢測器、SCL－10A控制器、CTO－10AS柱溫箱)，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 豆豉生產工藝及要點

豆豉:黑豆→篩選→浸泡(3倍的水，35℃浸泡16 h)→蒸煮(121℃，35 min)→冷卻至室溫→接種(接種量2%)→恒溫制曲(37℃下發酵72 h，每6 h翻曲1次)→配制(食鹽、老姜、花椒等)→入壇發酵→成品豆豉

混菌豆豉:接種(接種比例 D2∶U35=1∶1，接種量2%)，其余同豆豉生產。

1.3.2 異黃酮提取物的制備及含量檢測

其中：是狀態向量；是神經網絡的量測輸出；是神經網絡的估計輸出；是干擾輸入；；是連接權矩陣；是具有適當維數的常數矩陣；是常數輸入；是初始條件，變時滯滿足，是已知常數；是神經元的激活函數，滿足

豆豉→干燥→粉碎→過60目篩→稱取粉末100 g→石油醚脫脂→60%乙醇超聲提取2 h(重復3次)，料液比1∶20(g∶mL)→過濾→合并濾液→濃縮→異黃酮提取物［10］

色譜條件［11］:

色譜柱:Alltima C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇-乙酸-水(45∶0.5∶55);流速:1.0 mL/min;柱溫:25℃;進樣量:2 0 μL;檢測波長:254 nm。

1.3.3 LLC細胞的體外培養

將LLC的貼壁細胞接種在含有體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基中，在細胞培養瓶中吹打混勻后置于37℃、5%CO2孵化箱中培養、傳代。每日用倒置顯微鏡檢查細胞，如發現污染或細胞破碎，必須丟棄。

1.3.4 染料排斥法測定豆豉異黃酮提取物的抗腫瘤作用

調節細胞濃度至1×104/mL，取50 μL接種于96孔細胞培養板，每組3個平行孔，置于37℃、5%孵化箱中培養24 h。將消毒處理過的豆豉異黃酮提取物用無水乙醇溶解，配制 100，30，10，3，1 μg/mL 溶液分別加到不同孔中。每孔加入豆豉異黃酮提取液50 μL，置于37℃、5%CO2孵化箱中培養72 h。

培養72h后混勻，加 Hoechst溶液33342染液0.5 mL，0.9%生理鹽水0.3 mL，混勻，室溫下放置10 min。熒光顯微鏡下計數活細胞數及死細胞數［12］。

1.3.5 MTT法測定豆豉提取物對腫瘤細胞的殺傷作用

調節細胞濃度至1×104/mL，取100 μL接種于96孔細胞培養板，每組3個平行孔，置于37℃、5%孵化箱中培養24 h。將消毒處理過的豆豉異黃酮提取物用無水乙醇溶解，在孔中分別加入濃度為100，10，1，0.1，0.01 μg/mL 豆豉異黃酮提取液 10 μL。對照孔中加入10 μL無水乙醇。置于37℃、5%CO2孵化箱中培養72 h。MTT用無血清IMDM培養液配成1mg/mL 溶液，每孔中加入 50 μL，置于 37℃、5%CO2孵化箱中培養4h。吸出上清液，加入100 μL DMSO，用搖床搖勻。測定吸光度(OD570值)［13－14］。

1.3.6 MTT法測定對LLC細胞增殖的抑制作用

試驗分為豆豉組、溶劑對照組和空白對照組，其中豆豉組異黃酮提取物各劑量組分別為20，40，60，80，100，120，140 和160 μg/mL;溶劑對照組加入終濃度加0.1%的DMSO;空白對照組僅加入等體積培養液，不加藥物和細胞。

選用對數生長期的LLC細胞，經0.25%(g/v)胰蛋白酶消化，接種于96孔培養板內，預培養24 h，待細胞貼壁后吸出全部上清，按實驗分組加入不同濃度的各種受試物(總體積200 μL/孔)，每組3個平行。分別培養72 h和96 h，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT，繼續培養4h，棄去培養液，每孔加DMSO 200 μL，平板搖床搖震10 min，以DMSO調零，用酶聯免疫檢測儀以490 nm波長測定各孔吸光值(A)，計算平均A值和增殖率及抑制率［13－15］。

運用曲線回歸分析，求出劑量反應關系方程及回歸系數。

1.4 熒光顯微鏡下觀察細胞形態的變化

將細胞接種于96孔培養板內，預培養24h，溶劑對照組(0.1%DMSO)和實驗組豆豉異黃酮提取物(100 μg/mL)培養 24、48、72 和 96h，Hoechst33342 染色后倒置熒光顯微鏡下觀察［16］。

1.5 實驗數據處理

數據結果及圖形均采用Microsoft ExceL 2003軟件進行處理、制作，結果以均值±標準差(±s)表示。數據分析采用SAS v9.0軟件，異黃酮含量對LLC細胞抑制的影響采用逐步回歸分析［17］(SRA，stepwise regression analysis)。

2 結果與分析

2.1 豆豉提取物異黃酮各組分含量的測定結果

不同豆豉的糖苷型異黃酮、苷元型異黃酮含量的差異達到顯著水平(P＜0.05)(圖1)。D2、U35單菌豆豉和D2U35混菌豆豉的異黃酮總含量基本相同，D2U35混菌豆豉的苷元型異黃酮含量比D2單菌豆豉高 101.95 μg/mL，比 U35 單菌豆豉高 35.48 μg/mL。說明混菌發酵提高了苷元型異黃酮含量。

圖1 不同豆豉提取物異黃酮各組分的含量Fig.1 Isoflavones content of each component in different groups

2.2 豆豉異黃酮提取物對LLC細胞的體外抑瘤作用

利用染料排斥法測定豆豉異黃酮提取物的抗腫瘤作用，LLC細胞株的活細胞率見表1。在LLC細胞中接入不同濃度的異黃酮提取物，隨著濃度的升高，LLC細胞存活率不斷下降。當異黃酮提取物濃度為100 μg/mL時，對腫瘤細胞的抑制能力最強，D2、U35單菌豆豉的活細胞率分別比D2U35混菌豆豉高約6.99和4.12%。說明D2U35混菌豆豉的抗腫瘤能力分別比D2、U35單菌豆豉高約6.99%和4.12%。

表1 LLC細胞株的活細胞率Table 1 LLC living cells rate

2.3 MTT法測定豆豉異黃酮提取物對LLC細胞的體外殺傷作用

豆豉異黃酮提取物溶液作用于LLC細胞72h后，各劑量孔的吸光度(OD570值)見表2。隨著豆豉異黃酮提取物濃度的升高，A值逐漸減小，說明異黃酮提取物濃度越高對LLC細胞殺傷作用增大。當異黃酮提取物濃度升高到 10 μg/mL、100 μg/mL 時，D2、U35、D2U35豆豉對LLC細胞殺傷作用出現明顯差別。D2U35混菌豆豉對LLC細胞殺傷最大，分別比D2、U35單菌豆豉高約27.75%和12.14%。

表2 豆豉異黃酮提取物對LLC細胞的體外殺傷作用Table 2 Inhibition of isoflavones on LLC in vitro

2.4 MTT法檢測豆豉異黃酮提取物對LLC細胞抑制的影響

圖2、圖3中，控制豆豉提取物濃度和作用時間，豆豉提取物作用于LLC細胞72 h、96 h后，隨劑量的增加、時間的延長，LLC細胞抑制率提高，表明LLC細胞的抑制活性提高。當濃度到達100 μg/mL時，隨著濃度增加，抑制率變化緩慢。D2U35混菌豆豉對腫瘤的抑制率最高，分別比D2、U35單菌豆豉高15.79%和7.02%，說明D2U35混菌豆豉的抗腫瘤能力最高，其次是U35單菌豆豉，再次是D2單菌豆豉。

圖2 異黃酮提取物作用LLC細胞72 h的抑制率Fig 2 The effects of isoflavones on inhibitory rate in 72 h

圖3 異黃酮提取物作用LLC細胞96h的抑制率Fig 3 The effects of isoflavones on inhibitory rate in 96 h

利用數學分析法分析了豆豉總異黃酮含量、糖苷型異黃酮含量和苷元型異黃酮含量對LLC細胞抑制的影響。通過統計學得出回歸方程為Y=12.670 7+0.181 9n+0.255 5k，(n為總異黃酮含量，P＜0.001;k為苷元型異黃酮含量，P＜0.001)，P＜0.05具有統計學意義，R2=0.953 4，F=214.62。結果表明異黃酮各組分含量與LLC細胞增殖率成正相關，苷元苷型異黃酮含量對LLC細胞抑制影響較大，其次是總異黃酮含量。糖苷型異黃酮含量未被引入模型中，表明糖苷型異黃酮對LLC細胞的抑制影響較弱。

2.5 豆豉異黃酮提取物作用于LLC細胞的劑量反應關系、時間反應關系

對豆豉異黃酮提取物作用劑量分別與抑制率進行曲線回歸分析，獲得回歸方程，豆豉提取物作用劑量與抑制率的曲線回歸分析結果:D2豆豉72 h，y=12.865x0.649，R2=0.996 1;D2 豆 豉 96 h，y=19.081x0.5731，R2=0.982 2。U35 豆豉 72 h，y=14.75x0.6669，R2=0.976 1;U35 豆 豉 96h，y=22.294x0.5399，R2=0.973 9。D2U35 豆豉 72 h，y=16.703x0.6093，R2=0.995 4;D2U35 豆豉 96 h，y=24.7620.4149，R2=0.978 1。從以上數據看出豆豉異黃酮提取物作用劑量與抑制率之間均呈現出良好的劑量-反應關系、時間-反應關系(圖4)［12］。隨著豆豉異黃酮提取物濃度的增加，作用時間的延長，異黃酮提取物對LLC細胞的抑制能力增強。說明異黃酮提取物濃度越高，作用時間越長，抗腫瘤能力越強。

圖4 豆豉異黃酮提取物對LLC細胞抑制率的劑量-反應曲線、時間-反應曲線Fig.4 Dose-response curve of cell inhibitory rate of isoflavones on LLC cells

2.6 熒光顯微鏡下細胞形態的變化

經過連續傳代培養后，培養瓶中己見不到貼壁細胞，鏡下所見均為飽滿的懸浮細胞。用Hoechst33342染液染色后，活細胞為明亮藍色，凋亡細胞更為明亮。

與對照組相比，D2、U35單菌豆豉和D2U335混菌豆豉的異黃酮提取物作用于LLC細胞作用時間24h時，細胞均呈現飽滿的圓形;48h時，細胞呈現較飽滿的圓形，細胞出現破碎;72h時，破碎細胞增加，活細胞數明顯減少;96h時，細胞幾乎全部破碎，并且活細胞數量非常少(圖5)。隨著豆豉異黃酮提取物作用于LLC細胞時間的延長，D2、U35單菌豆豉和D2U335混菌豆豉對LLC細胞抗腫瘤能力逐漸增強。

3 討論

分別用染料排斥法、MTT法和細胞形態法3種方法測定了LLC細胞存活率、LLC細胞抑制率以及熒光顯微鏡下細胞形態的變化，得出結論:豆豉異黃酮提取物濃度越大，作用于LLC細胞的時間越長，對LLC細胞的抑制能力越強。通過逐步回歸分析得出:異黃酮含量與LLC細胞腫瘤的抑制率成正比。對腫瘤抑制作用:苷元苷型異黃酮＞總異黃酮＞糖苷型異黃酮。

混菌豆豉苷元型異黃酮含量分別比D2、U35單菌豆豉高101.95 μg/mL 和35.48 μg/mL，是D2 單菌豆豉的2.38倍，是U35單菌豆豉的1.25倍。D2U35混菌豆豉對腫瘤細胞的抑制率分別比D2、U35單菌豆豉高15.79%和7.02%。說明混菌發酵不僅提高了苷元型異黃酮含量，還提高了豆豉提取物抗腫瘤能力。通過混菌發酵生產豆豉，提高苷元型異黃酮含量的同時提高了豆豉抗腫瘤能力，為將豆豉開發成為新一代功能性食品提供重要的參考。

圖5 豆豉異黃酮提取物作用于LLC細胞不同時間的細胞形態變化Fig.5 Morphologic change of LLC cells exposed to different treatments

［1］ Anderson R L，Wolf W J.Compositional changes in trypsin inhibitors，phytic acid，saponin and isoflavones related to soybean processing［J］.Nutr，1995，125(2):24 － 31.

［2］ Zhang J，Yu O.Metabolic engineering of isoavone biosyn thesis in seeds［M］.American:American Society of Agronomy，2008.

［3］ Adlercreutz H，Hockerstedt K，Bannwart C，et al.Effects of dietary components in cluding lignans and phytoestrogens on enterohe patic circulation and liver metabolism of estrogen s and on sex hormone binding globulinJ［J］.Journal of Steroid Biochemistry，1987，27(5):1 135 －1 141.

［4］ Setchell K D，Cassidy A.Dietary isoflavones:biological effects and relevance to human health［J］.Nutr，1999，129(3):758－767.

［5］ Su S J，Yeh T M，Lei H Y，et al.The potential of soybean foods as a chemoprevention approach of human urinary tract cancer［J］.Clin Cancer Res，2000，6(1):230 － 236.

［6］ 李琳，錢忠明.大豆異黃酮的藥理學作用和保健功能的研究進展［J］. 中國藥學雜志，2002，37(10):724.

［7］ 葛喜珍，王建華，李恩.中藥大豆中異黃酮的制備及開發利用進展［J］.河北中醫藥學報，2011，16(2):44－45.

［8］ Ming C H，Terrence L G.Partial purification and characterization of a soybean β-glucosidase with high specific activity towards isoflavone conjugates Biosei［J］.Phytochemistry，2001，58(7):995 －1 005.

［9］ 李小永.細菌型豆豉后發酵期間菌相分析及產蛋白酶菌種的篩選［D］.泰安:山東農業大學，2011.

［10］ Oyaizu M.Antioxidative activities of browning products of glucosamine fractionated by organic solvent and thin-layer chromatography［J］.Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi，1986，114(35):771 －775.

［11］ Gow-Chin Yen，Pin-Der Duh，Da-Yon Chuang.Antioxidant activity of anthraquinones and anthrone［J］.Food Chemistry，2000，70(6):437 －441.

［12］ 金瑩.濃縮蘋果汁中棒曲霉毒素的降解及蘋果多酚抗腫瘤作用的研究［D］.北京:北京林業大學，2010.

［13］ 鄭永唐，賁昆龍.測定細胞存活和增殖的MTT方法的建立［J］.免疫學雜志，1992，8(3):266－269.

［14］ 湯為學，駱云鵬，王瑞雪，等.人實體瘤抗癌藥物敏感試MTT法的建立［J］.重慶醫科大學學報，1992，17(21):103－108.

［15］ 黃領領.桑橙異黃酮對腫瘤細胞增殖抑制作用的實驗研究［D］.鄭州:鄭州大學，2009.

［16］ 張付利，厲永強，史齊，等.亞硝酸鈉對人肝癌細胞增殖與凋亡的影響［J］.中國藥理學通報，2011，27(2):191－195.

［17］ 程芳，陳偉.不同儲藏條件下玉米真菌多樣性研究［J］.中國糧油學報，2011，26(10):83－87.