1株高產(chǎn)凝乳酶菌株的鑒定及N+注入誘變選育*

洪豐，王志耕，梅林，薛秀恒

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品加工工程實(shí)驗(yàn)室，安徽省乳品工程技術(shù)研究中心，安徽合肥，230036)

干酪生產(chǎn)中應(yīng)用的凝乳酶主要有3類［1］，包括動(dòng)物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶，評(píng)價(jià)凝乳酶優(yōu)劣的兩個(gè)重要指標(biāo)是凝乳活力和蛋白水解力。近年來，由于世界干酪產(chǎn)量逐年上升，對(duì)凝乳酶的需求也不斷增大，因此，來源廣泛、價(jià)格低廉的微生物凝乳酶日益受到人們的重視［2］。

從自然界篩選出的天然菌株產(chǎn)酶能力一般不高，通過誘變選育是提高野生菌株產(chǎn)酶水平的有效途徑之一［3］。由于離子束獨(dú)特的生物學(xué)效應(yīng)，低能離子通過加速器注入生物體內(nèi)獲得加速，以動(dòng)量、質(zhì)量、能量和電荷共同作用于生物體細(xì)胞，在與生物體作用過程中，與生物體的分子、原子發(fā)生一系列的碰撞，產(chǎn)生突變，在輻照微生物育種過程中經(jīng)常表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢［4－5］。離子束誘變育種與傳統(tǒng)的化學(xué)和輻射誘變法相比，具有損傷輕、正突變率高、突變譜廣、遺傳穩(wěn)定、易于獲得理想菌種等優(yōu)點(diǎn)，是菌種選育的較理想方法［6］。

目前關(guān)于產(chǎn)凝乳酶菌株的誘變選育研究大多集中在霉菌和真菌，對(duì)細(xì)菌的報(bào)道較少。本研究以市售干酪為原料，從中分離出1株產(chǎn)凝乳酶的菌株，采用生理生化特征分析和16S rDNA序列分析的方法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，在此基礎(chǔ)之上首次采用低能氮離子束注入法對(duì)該種產(chǎn)凝乳酶細(xì)菌進(jìn)行誘變，探究離子注入的最佳條件，篩選高產(chǎn)凝乳酶株系，以期為細(xì)菌凝乳酶的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

菌株分離樣品來源于市售Mainland Edam Cheese(美蘭契達(dá)干酪)。

1.1.2 試劑和儀器

酪蛋白(高純級(jí)95%)，美國AMRESCO公司;微量生化鑒定管，杭州天和微生物試劑有限公司;Taq酶等PCR反應(yīng)試劑，上海生工生物工程有限公司;DNA提取試劑盒及凝膠回收試劑盒，北京天根;其他試劑均為分析純。

DHP060型恒溫培養(yǎng)箱，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司;PHS－3B精密pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠;SW－CJ－1F無菌操作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;IX51倒置式基礎(chǔ)型顯微鏡，日本奧林巴斯株式會(huì)社;Allegra 64R Centrifuge，美國BECKMAN COULTER公司;PCR擴(kuò)增儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司;培清JS－680D全自動(dòng)凝膠成像分析儀，上海培清科技有限公司;離子注入機(jī)，中國科學(xué)院等離子體物理研究所。

1.1.3 培養(yǎng)基

酪蛋白平板培養(yǎng)基:酪蛋白10 g、牛肉膏3 g、Na2HPO42 g、NaCl 5 g、瓊脂 15 g、蒸餾水 1 000 mL，pH 7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基:酪蛋白10 g、牛肉膏3 g、葡萄糖10 g、Na2HPO42 g、NaCl 5 g、蒸餾水 1 000 mL，pH 7.4。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗酶液的制備

在發(fā)酵培養(yǎng)基上按2%的比例接種菌液，37℃下120 r/min培養(yǎng)48 h，6 000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液。

1.2.2 凝乳活力測定方法［7］

Arima方法:取5 mL 100 g/L的脫脂乳，35℃保溫5 min，加入0.5 mL的發(fā)酵液，于旋渦混合器上混合，準(zhǔn)確記錄從加入酶液到乳凝固時(shí)間(min)。

1個(gè)索氏單位(SU):40 min凝固1 mL 100 g/L的脫脂乳的酶量。

式中:T為凝乳時(shí)間;D為酶液稀釋倍數(shù)。

1.2.3 蛋白水解活力測定方法［8］

取5 mL 1.2%酪素溶液，加1 mL稀釋10倍后的酶液，35℃保溫10 min，用5 mL 0.44 mol/L三氯醋酸終止酶反應(yīng)，繼續(xù)保溫20 min，反應(yīng)混合物用濾紙過濾。取濾液2 mL，加0.55 mol/L Na2CO3溶液5 mL后再加0.7 mol/L的Folin試劑1 mL，35℃保溫20 min，于660 nm波長處測量吸光度值。

式中:A為660 nm波長處吸光度值;K為標(biāo)準(zhǔn)曲線中光吸收為“1”時(shí)的酪氨酸量(μg/μg);V為酶促反應(yīng)的總體積/mL;t為酶促反應(yīng)時(shí)間/min;N為酶的稀釋倍數(shù)。

1.2.4 菌株的篩選

初篩:稱取奶酪5 g，迅速倒入帶玻璃珠的45 mL無菌水三角瓶中振蕩30 min，即成為10－1的懸浮液。將懸浮液梯度稀釋后涂布到酪蛋白平板上37℃培養(yǎng)48 h。從平板上挑取周圍有凝乳圈的單菌落劃線分離直至純培養(yǎng)。

復(fù)篩:將純培養(yǎng)物接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中37℃下120 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液6 000 r/min離心10 min，取其上清液測定凝乳活力，篩選出凝乳活力高的菌株。

1.2.5 菌株的鑒定

生理生化特征分析:對(duì)分離純化的菌株依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》提供的方法進(jìn)行生理生化特征分析鑒定［9－10］。

16S rDNA同源性序列分析:用試劑盒提取菌株的基因組 DNA，采用通用引物(正向引物27f:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物1492r:5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3')對(duì)菌株基因組進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50 μL):模板(約30 ng/μL)2 μL，dNTP(脫氧核苷三磷酸)1 μg，各 2.5 mmol/L，緩沖液 5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各 1 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，去離子水39.5 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸 90 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃再保溫10 min，保存于4℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送交上海生工生物工程有限公司測序并與GenBank(美國國家生物信息中心)中的相關(guān)屬種進(jìn)行比對(duì)，利用Clustal X 1.83和MEGA 5.0軟件并采用Neighbor-Joining(鄰接法)方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹和Bootstrap analysis(自舉法)方法進(jìn)行1 000次重復(fù)抽樣分析。

1.2.6 樣品處理與 N+注入［11－12］

以培養(yǎng)24 h的菌液稀釋1 000倍，取0.15 mL均勻涂布于無菌平皿上，用無菌風(fēng)吹干。取鏡檢無細(xì)胞重疊者進(jìn)行N+注入，注入能量選定為20 keV，注入劑量為0、1、2、3、4、5 × (0.52 ×1015ions/cm2)，靶室真空度為10－3Pa，離子注入每個(gè)劑量和能量是相對(duì)于該劑量和能量只接受相同時(shí)間的真空處理而言。將平皿置于水冷靶臺(tái)上，以5 s脈沖式注入，間隔55 s，然后取出平皿，以2 mL無菌水洗脫，涂布于酪蛋白平板，37℃培養(yǎng)3 d用于單菌落的挑選和存活率的計(jì)算。

1.2.7 存活率和正突變率的計(jì)算

存活率是指試驗(yàn)組平皿中的菌落平均數(shù)與對(duì)照組平皿中的菌落數(shù)之比。經(jīng)離子注入后的樣品，每皿用2 mL無菌水洗下，每個(gè)稀釋度取0.2 mL涂布于初篩培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)48 h后，統(tǒng)計(jì)存活細(xì)胞數(shù)A。未經(jīng)處理的對(duì)照組平皿同條件培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)存活細(xì)胞數(shù)B。A和B的比值即為存活率。

式中:A為實(shí)驗(yàn)組存活細(xì)胞數(shù);B為對(duì)照組存活細(xì)胞數(shù)。

取經(jīng)輻照處理后的單菌落分別進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，同時(shí)以出發(fā)菌株為對(duì)照，考察菌株凝乳活力。凝乳活力比出發(fā)菌株高5%以上為正突變菌株。

1.2.8 誘變菌株的選育

從酪蛋白平板上挑選凝乳圈較大且透明圈較小的誘變菌株，進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩。測定各菌株的凝乳活力、蛋白水解活力及凝乳效果，篩選出凝乳活力高、蛋白水解活力小及凝乳效果良好的菌株。

1.2.9 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)處理

進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，將篩選得到的誘變菌株連續(xù)6代斜面轉(zhuǎn)接、活化，并接種于發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，測定發(fā)酵液凝乳活力，每支斜面6個(gè)重復(fù)，所得結(jié)果取平均值。采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 18.0對(duì)遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果以mean±SD表示，具有穩(wěn)定遺傳的菌株即為目的菌株。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)過初篩和復(fù)篩共得到5株純培養(yǎng)物(見表1)。各菌在酪蛋白平板上均能生長，在菌落周圍有凝乳圈。由表1可知，5株測試菌株在凝乳活力、蛋白水解活力、酶活比值(凝乳活力/蛋白水解活力)指標(biāo)及凝乳效果上均存在差異，選取凝乳活力高、蛋白水解活力低、酶活比值高、凝乳效果良好的XC－1菌株作為后續(xù)研究及誘變出發(fā)菌株。

2.1 產(chǎn)凝乳酶菌株的分離純化篩選

表1 菌株篩選結(jié)果Table 1 Screening results of the strains

2.2 XC－1菌株生理生化鑒定

XC－1菌株生理生化指標(biāo)鑒定結(jié)果見表2，顯示其生物學(xué)特征與枯草芽孢桿菌屬的主要指標(biāo)相符合，初步判定該菌株為Bacillus subtilis。

表2 XC－1菌株的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characters of XC－1 strain

2.3 XC－1菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增和序列分析

2.3.1 XC－1菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增(圖1)

圖1 XC－1菌株16S rDNAPCR擴(kuò)增片段Fig.1 The PCR fragment of 16S rDNA of strain XC－1

用抽提的XC－1菌株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了一條大小約為1.5 kb特異的預(yù)期條帶。獲得的特異片段經(jīng)純化后測序，得到1 452 bp序列片段，其在GenBank上的登錄號(hào)為KC492497。2.3.2 XC－1菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建(圖2)

圖2 XC－1與相關(guān)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Fig.2 Phylogenetic tree of XC－1 based on the 16S rDNA sequences

將得到的序列與GenBank核酸序列庫中的序列進(jìn)行BLASTn(局部同源性比較)，結(jié)果表明，XC－1菌株與Bacillus subtilis的16S rDNA序列有較高的同源性，其中與Bacillus subtilis(NR027552)有99%的同源性。參考XC－1細(xì)菌16S rDNA在GenBank的比較結(jié)果，利用Clustal X1.83和MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，菌株XC-1與Bacillus subtilis(NR027552)構(gòu)成一個(gè)分支。細(xì)菌分類學(xué)家普遍認(rèn)為，當(dāng)16S rDNA序列同源性高于97%，可以認(rèn)為是屬內(nèi)的同種，低于95%，則可能為屬外成員［13］。因此，可確定菌株XC－1為Bacillus subtilis。

2.4 N+注入對(duì)XC－1菌株的誘變效應(yīng)

XC－1菌株經(jīng)N+注入處理后的存活率和正突變率如圖3所示。圖3顯示在同一能量場作用下，注入劑量在0～1.04×1015ions/cm2之間時(shí)，隨著注入劑量的增大，XC－1菌株的存活率明顯下降，注入劑量在1.04×1015～2.08×1015ions/cm2時(shí)存活率逐漸回升。

N+注入誘變的突變頻率與離子注入的劑量和能量有很大的相關(guān)性。當(dāng)XC－1菌株誘變存活率在20%～30%時(shí)能達(dá)到最高的正突變率。圖4顯示在能量為20 keV，劑量為2.08×1015ions/cm2時(shí)正突變率最高，達(dá)到27.2%，隨后正突變率又逐漸降低。

圖3 N+輻照的存活率和正突變率曲線Fig.3 Curves for the survival rate and positive mutation of strain irradiated by N+

綜合考慮菌株的存活率和正突變率，確立最佳誘變劑量值為2.08×1015ions/cm2。這個(gè)獲得較高正突變率的注入劑量范圍對(duì)應(yīng)在存活率25%左右的區(qū)間，這可能是由于在此劑量范圍內(nèi)菌體細(xì)胞受到的能量、動(dòng)量沉積和電荷交換等誘變因素最為豐富，能產(chǎn)生更廣的誘變譜［14］。

2.5 誘變菌株的選育

2.5.1 誘變菌株的篩選

誘變菌株的部分篩選結(jié)果見表3。觀察發(fā)現(xiàn)，XCYB－6菌株的凝乳活力最高為2 181.82 SU/mL，比出發(fā)菌株提高65.63%，同時(shí)，其蛋白水解活力最低(2.53 U/mL)，酶活比值最高(862.38)，該菌株的凝乳效果表現(xiàn)良好:凝乳時(shí)間最短，凝乳氣味良好，質(zhì)地光滑，硬度適中，均勻有光澤呈乳黃色。因此，選擇XCYB－6菌株為誘變選育目的菌株。

表3 氮離子束誘變菌株特性Table 3 Nitrogen ion beam mutant strains features

2.5.2 誘變菌株遺傳穩(wěn)定性檢驗(yàn)

遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和方差分析結(jié)果見表4。由表4可知誘變后篩選得到的XCYB－6菌株傳至第6代，凝乳活力穩(wěn)定在2 182.11～2 182.82 SU/mL之間。突變菌株XCYB－6凝乳活力6代間差異不顯著(P＞0.05)，表明誘變菌株具有很好的遺傳穩(wěn)定性，其性狀可以得到穩(wěn)定遺傳。

表4 誘變菌株XCYB－6不同代次的凝乳活力Table 4 Milk-clotting enzyme activity of mutant XCYB－6 of different generation

3 結(jié)論

N+束誘變處理可顯著提高枯草芽孢桿菌菌屬產(chǎn)凝乳酶的活力，最佳離子注入誘變條件為:能量20 keV、劑量2.08 ×1015ions/cm2。

本研究獲得1株可用于凝乳酶生產(chǎn)誘變菌株，其凝乳活力為2 181.82 SU/mL(比出發(fā)菌株提高65.63%)，蛋白水解活力為2.53 U/mL，遺傳穩(wěn)定性良好。

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