超聲波-LiCl對(duì)紅法夫酵母復(fù)合的誘變效應(yīng)*

徐彩榮，閆真真，朱傳合

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安，271018)

蝦青素是一種非VA源的類(lèi)胡蘿卜素，具有抗氧化性強(qiáng)、延緩衰老、抗癌等多種生物學(xué)功能［1］。目前，蝦青素的生產(chǎn)方法主要有生物發(fā)酵、從相關(guān)原料中提取、化學(xué)合成等方法，其中生物發(fā)酵法是最為理想的生產(chǎn)方法。常見(jiàn)的能夠產(chǎn)生蝦青素的微生物主要有雨生紅球藻、粘紅酵母、紅法夫酵母及乳酸分支桿菌等［2］。紅法夫酵母具有異養(yǎng)代謝快、培養(yǎng)時(shí)間短及可高密度培養(yǎng)等特點(diǎn)，成為國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)。

目前國(guó)內(nèi)外的學(xué)者針對(duì)紅法夫酵母所采用的誘變育種、原生質(zhì)體融合等技術(shù)均獲得了高產(chǎn)菌種［3－9］。超聲波誘變技術(shù)作為一種新型的物理誘變育種技術(shù)，不但克服了紫外線誘變易產(chǎn)生光修復(fù)問(wèn)題和化學(xué)誘變劑高毒性等缺點(diǎn)，而且具有操作方便、安全、誘變效果好等特點(diǎn)［10－13］，在植物及部分微生物育種方面得到了一定應(yīng)用。LiCl本身并無(wú)誘變作用，但在誘變育種中可與一些誘變因子表現(xiàn)出協(xié)同作用。關(guān)于超聲波及LiCl同時(shí)應(yīng)用于紅法夫酵母改良中還未見(jiàn)報(bào)道。本文旨在研究超聲波-LiCl對(duì)紅法夫酵母的復(fù)合誘變效應(yīng)，并采用推理選育原理進(jìn)行高產(chǎn)菌株篩選。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma TY-I-8)，系紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma ATCC 24202)經(jīng)過(guò)誘變選育的菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g，酵母粉3 g，蛋白胨5 g，自來(lái)水1 000 mL，pH自然;

搖瓶發(fā)酵初始培養(yǎng)基:葡萄糖20 g，酵母粉3 g，蛋白胨5 g，自來(lái)水1 000 mL，pH自然;

二苯胺篩選培養(yǎng)基:葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蛋白胨 20 g，瓊脂 20 g，二苯胺 140 μmol/L，自來(lái)水1 000 mL，pH 自然。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 出發(fā)菌株生長(zhǎng)測(cè)定

取活化后斜面種子1環(huán)接至盛有30 mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，20℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)48h。然后移取培養(yǎng)液以10%接種量接至另外39個(gè)盛有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，20℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)。每6 h取出3瓶，同時(shí)平行測(cè)定生物量和蝦青素含量，結(jié)果取平均值。24 h后改為每12 h取樣，132 h后結(jié)束。

1.2.2 菌懸液的制備

用無(wú)菌水洗脫酵母菌種，然后倒入滅過(guò)菌的小三角瓶中，在漩渦振蕩器上進(jìn)行振蕩使菌體分散均勻，用0.85%生理鹽水稀釋到106～108個(gè)/mL，即得菌懸液，備用。

1.2.3 誘變處理

1.2.3.1 超聲波誘變劑量的選擇

將菌懸液分裝于5mL規(guī)格離心管中，平均每管加樣3 mL。將離心管放在超聲波儀器中，在20 kHz，200 W條件下進(jìn)行超聲波處理;按離心管編號(hào)順序依次處理 8、12、24、30、36、42、48、54、60、66 min;平行 3份誘變處理。處理后的菌液稀釋一定梯度涂平板，并以相同條件下沒(méi)有經(jīng)過(guò)超聲波處理的菌液作對(duì)照，20℃培養(yǎng)6～7 d后計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算致死率和正突變率。

1.2.3.2 LiCl濃度的選擇

將經(jīng)過(guò)超聲波誘變處理適當(dāng)時(shí)間的菌懸液稀釋一定梯度后涂布于含濃度梯度為1、2、3、6、12 g/L的LiCl平板上，同條件下無(wú)LiCl的平板培養(yǎng)基為對(duì)照樣，20℃培養(yǎng)6～7 d后計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算致死率和正突變率。

1.2.4 致死率和正突變率測(cè)定

菌株的致死率為其經(jīng)過(guò)超聲波誘變后在平板培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落數(shù)與同條件下未經(jīng)誘變處理的對(duì)照菌株在平板培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落數(shù)的比值。正突變率為蝦青素含量與對(duì)照菌株相比提高在5%以上的突變菌株占全部被考察菌株的比例。

1.2.5 二苯胺最適篩選濃度的確定

分別移取適量0.01 mol/L的二苯胺溶液，添加到完全培養(yǎng)基中，制成不同梯度(分別含二苯胺10、20、40、60、80、100、120、140、160 mol/L)的二苯胺平板，每個(gè)梯度做3個(gè)平行。取0.1 mL稀釋好的菌懸液涂布于上述二苯胺平板上，置于20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d，待菌落長(zhǎng)出后，觀察菌落生長(zhǎng)情況，選擇最適二苯胺濃度。

1.3 分析方法

菌體生物量及蝦青素測(cè)定:參照zhu等人報(bào)道方法［18］。

2 結(jié)果與分析

2.1 出發(fā)菌株生長(zhǎng)特性測(cè)定

按照1.2.1的方法測(cè)定出發(fā)菌株的生長(zhǎng)曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，搖瓶發(fā)酵36 h后酵母生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，當(dāng)酵母生長(zhǎng)84 h后達(dá)到了穩(wěn)定期，至120 h以后進(jìn)入衰退期，生物量開(kāi)始顯著降低。蝦青素的積累在紅法夫酵母生長(zhǎng)的初期緩慢地增長(zhǎng)，在酵母生長(zhǎng)36 h后蝦青素產(chǎn)量開(kāi)始明顯增大，當(dāng)發(fā)酵到84 h后紅法夫酵母生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，蝦青素產(chǎn)量繼續(xù)增加，到120 h后酵母生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期，生物量、蝦青素產(chǎn)量隨之降低。

圖1 出發(fā)菌株生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of original strain

2.2 超聲波對(duì)酵母菌株致死率與正突變率的影響

按照1.2.3.1的方法進(jìn)行超聲波誘變處理，繪制致死率及正突變率曲線，結(jié)果如圖2所示。

由圖2中可知，隨著超聲時(shí)間的增加，紅法夫酵母菌株的致死率和正突變率逐漸增大，當(dāng)超聲誘變時(shí)間為60 min時(shí)致死率為79.3%，正突變率達(dá)到最大值為30.5%。據(jù)報(bào)道致死率在70% ～80%，微生物正向突變率較高［19］。選擇超聲誘變時(shí)間為60 min。

圖2 超聲波誘變對(duì)菌株致死率及正突變率的影響Fig.2 The death rate and positive rate and positive rate of strain by Ultrasonic

2.3 超聲波-LiCl復(fù)合誘變對(duì)菌株致死率與正突變率的影響

按照1.2.3.2的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

表1 超聲波-LiCl復(fù)合誘變對(duì)紅法夫酵母菌株致死率和正突變率的影響Table 1 The effect of death rate and positive rate on Phaffia rhodozyma by Ultrasonic-LiCl

由表1可知，LiCl濃度在1 g/L以下時(shí)，對(duì)紅法夫酵母致死率沒(méi)有明顯影響(P＞0.05)，當(dāng)LiCl濃度在2～12 g/L時(shí)，紅法夫酵母的致死率隨著LiCl濃度的提高而提高。正突變率隨著LiCl濃度的升高出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。總的來(lái)說(shuō)，復(fù)合誘變效果較好，LiCl在一定濃度范圍內(nèi)能顯著提高正突變率。由表1可知，隨著LiCl濃度的增加酵母菌落逐漸變小，細(xì)胞顏色逐漸變淺，菌落之間差異明顯。本實(shí)驗(yàn)選取2 g/LLiCl濃度與超聲波進(jìn)行復(fù)合誘變。

2.4 蝦青素高產(chǎn)菌株的篩選

2.4.1 二苯胺篩選劑量的選擇

本實(shí)驗(yàn)研究了不同二苯胺濃度下紅法夫酵母菌株的生長(zhǎng)狀況，其結(jié)果如表2所示。

表2 酵母菌株二苯胺抗性實(shí)驗(yàn)Table 2 Resistance test about diphenylamine of Phaffia rhodozyma

由表2可以看出，二苯胺濃度為10 μmol/L時(shí)菌落生長(zhǎng)無(wú)明顯變化，當(dāng)二苯胺濃度為60～120 μmol/L時(shí)菌落顏色變成淺紅色和白色，當(dāng)二苯胺濃度為140 μmol/L時(shí)，菌落全部變成白色、菌落小、生長(zhǎng)慢，濃度達(dá)到160 μmol/L時(shí)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后仍無(wú)菌落生長(zhǎng)，因此，選擇二苯胺篩選濃度為140 μmol/L。

2.4.2 高產(chǎn)菌株的篩選

將超聲誘變60 min后的菌懸液適當(dāng)稀釋后涂布到含2g/LLiCl的平板培養(yǎng)基上，待菌落長(zhǎng)出后，挑選出菌落大、顏色紅而油亮的菌株1 627株，轉(zhuǎn)接到含二苯胺(140 μmol/L)的斜面培養(yǎng)基中，20℃培養(yǎng)6～7 d后選取生長(zhǎng)快、顏色亮而紅的菌株453株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測(cè)定蝦青素含量和生物量。選取生物量和蝦青素含量高于出發(fā)菌株25%的突變株119株進(jìn)行復(fù)篩，測(cè)定生物量和蝦青素含量，測(cè)定3次取平均值，部分結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 超聲波-LiCl復(fù)合誘變二苯胺篩選的復(fù)篩結(jié)果Table 3 The results of second screening about Ultrasonic-LiCl Mutagenic and diphenylamine screening

由表3可知，經(jīng)過(guò)超聲波-LiCl復(fù)合誘變處理后，紅法夫酵母合成蝦青素的水平得到有效提高，部分誘變株的生物量和蝦青素含量較突變株均有不同程度的提高。

2.5 高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

根據(jù)復(fù)篩結(jié)果選取蝦青素含量比較高的前五株菌株 UL－1、UL－2、UL－3、UL－4、UL－5，進(jìn)行高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，測(cè)定菌株的蝦青素含量，測(cè)定3次取平均值，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性結(jié)果Table 4 The high-yield strain genetic stability test

由表4可知，菌株 UL－1、UL－4、UL－5經(jīng)過(guò)傳代后，蝦青素含量有所下降，而菌株UL－2、UL－3顯示出較好的遺傳穩(wěn)定性。UL－2的生物量和蝦青素含量最高，分別為8.52 g/L和856.72 μg/g，比出發(fā)菌株分別提高了95.86%和289.42%，蝦青素產(chǎn)量高達(dá) 7 299.25 μg/L。

3 結(jié)論

(1)研究了不同超聲處理時(shí)間對(duì)紅發(fā)夫酵母菌株存活率及正突變率的影響，結(jié)果表明，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，酵母菌株的致死率及正突變率逐漸升高，當(dāng)超聲誘變時(shí)間為60 min時(shí)，正突變率達(dá)到最大值為30.5%。超聲波-LiCl復(fù)合誘變效應(yīng)表明，LiCl在一定濃度范圍內(nèi)能顯著提高正突變率，復(fù)合誘變效果明顯。

(2)采用超聲波60 min及LiCl 2 g/L進(jìn)行復(fù)合誘變，并選擇二苯胺進(jìn)行推理選育，最終篩選出1株遺傳性能穩(wěn)定的蝦青素高產(chǎn)菌株UL－2，其生物量和蝦青素含量分別比出發(fā)菌株提高了95.86%和289.42%。

(3)本研究首次將超聲波-LiCl復(fù)合誘變技術(shù)、二苯胺推理選育技術(shù)應(yīng)用到高產(chǎn)蝦青素紅發(fā)夫酵母菌株的選育中。研究證實(shí)超聲波-LiCl復(fù)合誘變技術(shù)可以有效進(jìn)行紅法夫酵母菌株改良;二苯胺能對(duì)突變型菌株進(jìn)行濃縮，提高菌種的篩選效率。

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