永川豆豉制曲過程中基本成分及生物胺含量變化*

胡鵬，胡國洲，陳光靜，索化夷，闞建全，2，3

1(西南大學食品科學學院，重慶，400715)2(重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶，400715)3(農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(重慶)，重慶，400715)

生物胺是一類具有生物活性的低分子量含氮有機化合物，食品中的生物胺主要由微生物氨基酸脫羧酶對氨基酸進行脫羧作用而形成［1］。生物胺是動物、植物和多數微生物體內的生理物質，適量的生物胺具有促進生長、增強代謝活力、加強腸道免疫系統、控制血壓和消除自由基等生理功能［2］。但是高濃度的生物胺會嚴重影響食品風味甚至改變其成分，還會對人體產生毒害作用，造成人體神經系統和心血管系統損傷。可能含有高濃度生物胺的食品包括:易被微生物侵染的肉制品、魚類、奶酪、發酵飲料、發酵肉制品和發酵豆制品［3－5］。由于生物胺具有潛在的毒性，目前食品中的生物胺已成為研究的熱點問題。

豆豉具有較高的食用價值和一定的藥理作用，是廣大人民喜愛的佐餐佳品［6］。永川豆豉是中國豆豉四大品系中毛霉型豆豉的代表產品。隨著對食品安全重視程度的增加，生物胺在中外傳統發酵食品中含量也越來越受到關注，但是有關豆豉中生物胺的研究目前還缺乏。目前建立的生物胺分析方法主要有:薄層色譜法、毛細管電泳法、氣相色譜法、高效液相色譜法、氨基酸分析法［7］。本課題主要研究永川豆豉制曲過程中生物胺的種類和含量的變化，并同時跟蹤研究在制曲過程中水分、總酸和氨基酸態氮等基本成分的變化，以期對永川豆豉制曲成熟及豉曲的品質及安全控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用實驗原料為永川豆豉食品有限公司經天然制曲，取自處于不同制曲時間的永川毛霉型豆豉。原料大豆產地黑龍江省。

腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、色胺、2－苯乙胺、組胺、酪胺、苯甲酰氯 (純度98%以上)，美國Sigma公司;甲醇(色譜級)，天津四友精細化工廠;高氯酸(分析純)、HCl(分析純)重慶川東化工有限公司;甲醛溶液(分析純)、NaOH(分析純)、NaCl(分析純)，成都科龍化工試劑廠;水為超純水。

1.2 儀器與設備

LC－10A高效液相色譜儀(含紫外檢測器)，日本島津公司;Milli－Q超純水器，美國Millipore公司;可調式氮吹儀，北京中諾遠東公司;微型漩渦混合儀，滬西分析儀器廠;臺式高速離心機，德國Eppendorf公司;FS－2可調高速勻漿機，江蘇金壇科析儀器有限公司;DK－8D三孔電熱恒溫水槽，上海齊欣科學儀器有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司;磁力加熱攪拌器，常州澳華儀器有限公司;PH計，賽多利斯科學儀器有限公司。

1.3 生物胺的HPLC測定方法

1.3.1 樣品的衍生

2 mL的生物胺標準混合溶液，加入1 mL 2 mol/L NaOH，10 μL 苯甲酰氯，然后旋渦振蕩30 s，在黑暗中置于30℃水浴條件下避光反應40 min，期間每隔10 min振蕩1次。反應完后用2 mL飽和NaCl溶液中斷反應。然后用3 mL乙醚萃取，1 200 r/min離心10 min，用移液槍移取乙醚層，再重復1次，將乙醚層移置于規格為10 mL的離心管中，35℃下氮氣吹干，然后用1 mL甲醇(色譜級)溶解，微濾(0.45 μm)后用于測定生物胺含量［8］。

1.3.2 標準生物胺溶液的配制

準確稱取腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、色胺、2-苯乙胺、組胺、酪胺各50 mg，用0.1 mol/L的HCl定容至50 mL，制成標準儲備液備用。

分別取以上標準儲備液，用0.1 mol/L HCl配制成終濃度分別為 1.0、2.0、5.0、10、20、40、80 μg/mL的混合標準溶液。然后按1.3.1方法進行衍生處理和分析，并繪制標準曲線。

1.3.3 樣品預處理

稱取10.0 g用研缽研磨均勻的豆豉樣品，置于100 mL離心管中，加20 mL 0.4 mol/L HClO4溶液分散，用勻漿機勻漿1 min，振蕩提取5 min，靜置5 min，然后在6 800 r/min離心30 min;將上清液移入50 mL容量瓶中，用20 mL HClO4溶液重復提取1次，上清液合并，用0.4 mol/L HClO4溶液定容至50 mL，取2 mL該溶液按1.3.1中的方法衍生處理。

1.3.4 液相色譜分析條件［9］

色譜柱:Agilent XDB-C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相A為超純水，流動相B為甲醇;梯度洗脫(洗脫條件:0～5 min，40%A;5～10 min，40%A→35%A;10～15 min，35%A→30%A;15～20 min，30%A→25%A;20～25 min，25%A→15%A;25～30 min，15%A→5%A;30 ～35 min，5%A→0%A;35 ～36 min，0%A→40%A;36 ～45 min，40%A);流速為1.0 mL/min;紫外檢測波長為254 nm;進樣量20 μL;柱溫 30℃。

1.4 理化指標測定方法

水分含量測定:采用常規的烘箱干燥法，見GB/T 5009.3 －2003［10］;總酸含量測定:采用酸堿滴定的酸度計法［11］;氨基態氮含量測定:采用甲醛滴定法，見 SB/T 10170 －2007［11］。

2 結果與分析

2.1 生物胺標準品的HPLC圖

通過單個生物胺標準樣品的HPLC檢測，得到8種生物胺的保留時間。其中，腐胺、尸胺、色胺、2-苯乙胺、亞精胺、精胺、組胺、酪胺的保留時間分別為7.068 min、8.144 min、9.826 min、11.490 min、12.778 min、18.346 min、20.359 min和23.980 min。混合生物胺的HPLC檢測結果可以得出該方法對8種生物胺的分離效果較好(見圖1)。8種生物胺標準曲線的回歸方程見表1，R2均在0.993 1～0.999 7，說明8種生物胺的峰面積與其相應濃度呈現良好的線性相關性。

圖1 生物胺標準品的液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of biogenic amines standards

表1 生物胺標準曲線的回歸方程及R2Table 1 Regression equation and R2of biogenic amines standard curve

2.2 制曲過程中豆豉水分含量的變化

由圖2可知，永川豆豉制曲過程中水分含量呈明顯下降的趨勢。制曲過程0天時水分含量最高，為46.97%，到制曲過程第11天時水分含量最低，已降至33.75%，這是由于制曲過程中水分蒸發、微生物利用等原因造成的。

圖2 永川豆豉制曲過程中水分含量的變化Fig.2 Water content change during Yongchuan douchi koji processing

2.3 制曲過程中豆豉總酸含量的變化

總酸含量直接影響永川豆豉制曲過程中各種酶的活性，也間接影響微生物的生長代謝，從而對豉曲質量的好壞也產生很大的影響。由圖3可知，永川豆豉制曲過程中總酸的含量呈先上升后下降的趨勢，大豆蒸煮結束時的總酸含量為1.53 g/100 g，到制曲過程第8天時總酸含量達到最高，為5.05 g/100 g，而到第11天時已降至4.27 g/100 g。這是由于制曲前期部分細菌得到一定程度生長導致酸性代謝物質增多，從而使總酸含量增大，但隨著蒸發，水分含量下降、毛霉大量繁殖使豆豉總酸含量下降。

圖3 永川豆豉制曲過程中總酸值的變化Fig.3 Total acid value change during Yongchuan Douchi koji processing

2.4 制曲過程中豆豉氨基態氮含量的變化

在豆豉成熟過程中，氨基酸態氮含量高低是判斷豆豉是否成熟的重要指標。如圖4所示，永川豆豉在制曲過程中氨基酸態氮含量呈先增加后下降的趨勢。到第8天時氨基酸態氮含量達到最高，為0.55 g/100 g，隨后氨基酸態氮含量有所降低。

圖4 永川豆豉制曲過程中氨基態氮含量的變化Fig.4 Amino nitrogen content change during Yongchuan Douchi koji processing

2.5 永川豆豉制曲過程中單種生物胺含量的變化

永川豆豉在制曲過程中生物胺含量變化見表2。在永川豆豉制曲過程中共檢測出7種生物胺，分別是腐胺、尸胺、色胺、2-苯乙胺、亞精胺、組胺、酪胺，而精胺在整個制曲過程中都沒有檢出。在各個制曲階段，腐胺的含量都是最高的，其次是尸胺和組胺。永川豆豉制曲過程中各種生物胺含量都在不斷變化，色胺、2-苯乙胺由最初的未檢出分別增加到53.59 mg/kg、52.02 mg/kg;組胺也由制曲初期的18.49 mg/kg減少到幾乎為0;酪胺也由最初的未檢出緩慢增長到20.57 mg/kg，隨后含量降到幾乎為0;腐胺含量變化呈緩慢的增長;各種生物胺含量均在60 mg/kg以下。美國食品藥品監督局規定了水產品中組胺含量為不得超過 50 mg/kg［12］。Nout等［13］認為發酵食品中 2-苯乙胺含量在30 mg/kg以上就可對人體構成潛在的危險。可見永川豆豉在制曲過程中組胺含量一直低于對人體產生危害的上述含量值50 mg/kg，但制曲后期2－苯乙胺含量高于上述含量值30 mg/kg。

表2 制曲過程中永川豆豉生物胺的濃度(mg/kg)Table 2 Contents of biogenic amines during Yongchuan Douchi koji processing

2.6 制曲過程中豆豉生物胺總量的變化

對不同制曲時間的永川豆豉進行檢測，能檢出7種生物胺，只有精胺未能檢出。如圖5所示，制曲過程中生物胺總量初期上升后期下降，變化范圍在108.64～234.37 mg/kg。制曲0天時生物胺總量最低為108.64 mg/kg，制曲第8天生物胺總量上升到最高值，為234.37 mg/kg，隨后生物胺總量開始下降。Santos［14］認為食品中生物胺總量超過1 000 mg/kg會對人體健康產生極大威脅。可見制曲過程中豆豉生物胺總量一直低于對人體產生危害的上述含量值1 000 mg/kg。生物胺總量的變化趨勢基本與氨基酸態氮基本一致，這與其他相關報道的結果一致［15－16］。

圖5 永川豆豉制曲過程中生物胺總量的變化Fig.5 Total biogenic amine content change during Yongchuan Douchi koji processing

3 結論

永川豆豉在制曲過程中，水分含量呈下降趨勢，由最初的46.85%降到33.75%;總酸和氨基態氮的含量均呈先增加后下降的趨勢。制曲過程中共檢測出7種生物胺，分別是腐胺、尸胺、色胺、2-苯乙胺、亞精胺、組胺、酪胺，而精胺在整個制曲過程中都沒有檢出。制曲過程中豆豉中主要以腐胺、色胺和2-苯乙胺為主，含量分別達到59.67、53.59、52.02 mg/kg，三者共占生物胺總量的78.81%，所有生物胺含量均在60 mg/kg以下。為了深入了解永川豆豉制曲過程中生物胺的變化的原因，生物胺產生機理還需進一步研究。

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